Regulation of blocked-DSB repair by DNA-PKcs and ATM kinases

Abstract

Trabajo presentado para optar al grado de Doctora en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica en la Universidad de Sevilla-CABIMER, Departamento de Biología del Genoma.--Calificación: Sobresaliente CUM LAUDEDada la amenaza que suponen las roturas del ADN de doble cadena para la integridad del genoma, conocer los mecanismos moleculares implicados de su reparación es extremadamente relevante. En particular, las estructuras de los extremos que presentan las roturas de doble cadena definen su complejidad y son consideradas posibles determinantes de la elección de la ruta por las que van a ser reparadas y del resultado de dicha reparación. Sin embargo, esta cuestión no ha sido suficientemente esclarecida debido a la dificultad de inducir roturas homogéneas con extremos que presenten estructuras definidas. Gracias al reciente desarrollo de un método genético para inducir roturas con extremos homogéneos, hemos diseccionado las rutas requeridas para reparar las roturas de doble cadena inducidas por la Topoisomerasa 2 cuando los extremos se encuentran específicamente limpios o bloqueados en G0/G1. Para ello, hemos caracterizado la implicación de factores identificados en escrutinios genéticos realizados con la técnica CRISPR/Cas9 y otros candidatos relacionados con los factores previamente identificados. De esta manera, hemos identificado que existe una preferencia para reparar las roturas producidas por la Topoisomerasa 2 a través de la actividad de TDP2 en vez del procesamiento llevado a cabo por las nucleasas, que sólo son necesarias cuando los extremos están bloqueados de una forma irreversible. Esta jerarquía contribuye a asegurar la estabilidad del genoma y no se mantiene en ausencia de DNA-PKcs. También demostramos que la función de ATM en la reparación de las roturas bloqueadas está principalmente relacionada con la ruta nucleolítica, aunque también podría estar implicada en la protección de los extremos frente a un excesivo procesamiento. Además, demostramos que esta jerarquía que prioriza la actividad de TDP2 impide la transformación a células malignas y el desarrollo de cáncer