In-vivo-Modelle der Toxoplasma gondii-Infektion von Huhn und Pute

Abstract

Einleitung: Toxoplasma (T.) gondii ist ein weltweit verbreitetes Protozoon warmblütiger Tiere und des Menschen. Einer der größten Risikofaktoren einer Infektion des Menschen mit T. gondii ist der Verzehr von rohem oder nicht ausreichend gegartem Fleisch und Fleischerzeugnissen. Geflügel wird als ein bedeutender Zwischenwirt im Lebenszyklus von T. gondii angesehen. Gegenwärtig gibt es aber nur wenige Untersuchungen zur Persistenz und Gewebeverteilung von für den humanen Konsum relevanten Organen und Geweben von T. gondii der Pute (Meleagris gallopavo) und des Haushuhns (Gallus gallus domesticus). Ziel der Untersuchung: Ziel im ersten Teil der vorliegenden Arbeit war es, die Persistenz von T. gondii in verschiedenen Geweben von Huhn und Pute unter Berücksichtigung der üblichen Mastperioden zu ermitteln. Im zweiten Teil der Arbeit wurde unter Simulation der natürlich auftretenden Infektionswege ein Infektionsmodell bei Huhn und Pute unter Nutzung von drei verschiedenen T. gondii-Stämmen etabliert. In diesem Modell wurde der Einfluss der Parameter Infektionsdosis, -stadium und -stamm auf die Verteilung von T. gondii im Gewebe von Huhn und Pute sowie die Serokonversion in den Zielspezies evaluiert. Tiere, Material und Methoden: 108 Puten und 96 Hühner wurden als Eintagsküken eingestallt. Die zur Infektion der Hühner und Puten benötigten Entwicklungsstadien von T. gondii wurden durch Passagen in der Zellkultur (Tachyzoiten), Infektion von Mäusen (Zysten) und durch Infektion von Hauskatzen (Oozysten) gewonnen. Die Evaluierung der Persistenz erfolgte nach intravenöser Gabe von 106 Tachyzoiten des Typ III-Stammes (NED) vier, acht, zwölf und 16 Wochen post infectionem (p.i.) bei Puten und fünf und zehn Wochen p.i. bei Hühnern. Die natürlichen Infektionswege wurden mit der oralen Verabreichung von Gewebezysten (ein Mausgehirn je Tier) oder Oozysten (103, 105 oder 106) eines T. gondii-Stammes der klonalen Linien der Typen II (ME49, Feldstamm CZ-Tiger) und III (NED) über eine Versuchsdauer von acht Wochen bei Puten und fünf Wochen beim Huhn simuliert (n = 6). Zum Versuchsende wurden die Tiere tierschutz-gerecht narkotisiert und durch Dekapitation getötet. Es wurden 16 verschiedene Gewebe (u.a. Gehirn, Herz, Muskulatur, Muskelmagen) entnommen und die Gewebeverteilung der Zysten von T. gondii mittels konventioneller Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und magnetic-capture real-time PCR untersucht. Für die serologische Untersuchung von Blutproben wurden ein kinetischer enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) und ein Immunfluoreszenzantikörpertest (IFAT) verwendet. Die Blutentnahmen erfolgten am Tag der Infektion und anschließend wöchentlich bis Versuchsende. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test und Mann-Whitney-U-Test (Unterschiede Infektionsgruppen in Serokonversion und Gewebeverteilung) und dem Friedman-Test (Organverteilung) analysiert. Signifikante Unterschiede wurden bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 angenommen. Ergebnisse: In allen 16 untersuchten Geweben von Pute und Huhn konnte nach Infektion mit Tachyzoiten, Zysten oder Oozysten T. gondii-DNA detektiert werden. Nach Tachyzoiteninfektion waren bei der Pute insgesamt 15,9 % der Gewebeproben positiv für T. gondii-DNA, wobei es sich bei 7,8 % der Proben um essbare Gewebe (Oberschenkel-, Unterschenkel-, Brustmuskulatur, Herz, Leber, Muskelmagen) handelte. Zwischen den vier Untersuchungszeitpunkten waren bei der Pute keine signifikanten Unterschiede in der Nachweisrate feststellbar. Bei Hühnern führten die Infektionen mit Tachyzoiten zu vier Nachweisen (2,1 %) von T. gondii, davon in drei Proben fünf Wochen p.i. (Pankreas, Unterschenkelmuskulatur, Retina) und in einer Probe zehn Wochen p.i. (Herz). Ein statistischer Vergleich der Untersuchungszeitpunkte war aufgrund der wenigen positiven Befunde nicht möglich. Die Infektionen mit Zysten oder Oozysten ergaben hohe Nachweisraten in Gehirn (Pute 44,4 % - 64,1 %, Huhn 18,8 % - 38,5 %) und Herz (Pute 5,6 % - 28,2 %, Huhn 31,3 % - 53,8 %). sowie Muskelmägen (Pute 16,7 % - 20,5 %, Huhn 6,3 % - 25,6 %). Bei Infektionen mit Oozysten der Typ II-Stämme stiegen mit der Infektionsdosis auch die Positivraten bei Huhn und Pute. Infektionen mit dem Typ III-NED-Stamm führten zu signifikant niedrigeren Nachweisraten bei Huhn (1,9 %) und Pute (5,7 %) als solche mit den Typ II-Stämmen ME49 (Huhn: 16,4 %, Pute: 18,8 %) und CZ-Tiger (Huhn: 27,8 %; Pute: 11,7 %). Eine Serokonversion trat bei Huhn und Pute ab einer Woche p.i. auf. Mit steigender Dosis von Typ II-Stamm Oozysten war bei beiden Spezies eine frühere Serokonversion nachweisbar. Schlussfolgerungen: Das in der vorliegenden Arbeit etablierte In vivo-Modell ist geeignet, Hühner und Puten auf verschiedenen Wegen mit T. gondii zu infizieren. Die Nachweise von T. gondii-DNA in Organen und Geweben, auch in zum menschlichen Verzehr genutzten, bei Hühnern bis zu fünf Wochen p.i. und Puten bis zu 16 Wochen p.i. zeigen eine Persistenz von T. gondii bis mindestens zur Schlachtreife an. Das Risiko einer Infektion des Verbrauchers mit T. gondii beim Verzehr von nicht ausreichend gegartem Geflügelfleisch oder Geflügelfleischerzeugnissen oder dem Umgang mit rohem Fleisch oder sonstigem Gewebe von Geflügel ist demzufolge grundsätzlich gegeben. Die Rolle von Geflügel oder anderen Vögeln in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose ist aber noch nicht gänzlich klar und verdient weitere Aufmerksamkeit.:1. Einleitung 2. Literatur 2.1. Toxoplasma gondii 2.1.1. Erreger 2.1.2. Entwicklungszyklus 2.1.3. Genetik und Virulenz 2.1.4. Nachweismöglichkeiten 2.1.4.1. Bioassay 2.1.4.2. Polymerase-Kettenreaktion 2.1.4.3. Serologie 2.2. Bedeutung für den Menschen 2.2.1. Humane Toxoplasmose 2.2.2. Risikofaktoren 2.3. Bedeutung der Toxoplasmose des Geflügels 2.3.1. T. gondii-Infektion des Huhnes 2.3.2. T. gondii-Infektion der Pute 3. Publikationen 3.1. Publikation 1 3.2. Publikation 2 3.3. Publikation 3 3.4. Publikation 4 4. Diskussion 4.1. Klinische Beobachtungen 4.2. Serologische Untersuchungen 4.2.1. Serokonversion und Infektionsstadium 4.2.2. Serokonversion und Infektionsdosis 4.2.3. Serokonversion und Infektionsstamm 4.3. Gewebeverteilung 4.3.1. Persistenz von T. gondii im Gewebe von Geflügel 4.3.2. Prädilektionsstellen bei Hühnern und Puten 4.3.3. Einflussfaktoren auf die Organverteilung 4.3.4. Einfluss der Methodik 4.4. Weitere Einflussfaktoren auf die Untersuchungen 4.5. Zusammenfassung der Diskussion 5. Zusammenfassung 6. Summary 7. Literaturverzeichnis Danksagun