Cruz, Élida Glória Pinto

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Repositório do INPA

XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA Manaus - 2009EFEITO DA EXCLUSÃO DE VITAMINAS DO MEIO COMPLETO DEPONTECORVO (MC) NO CRES.CIMENTO MICELIAL E PRODUÇÃO DEMETABÓLITOS ANTIMICROBIANOS POR Flammulina velutipesÉlida Glória Pinto CRUZ1; Ruby VARGAS-ISLA2; Noemia Kazue ISHIKAWA3'Bolsista PIBIC/CNPq/INPA; 2Doutoranda CPBA/ INPA; 30rientadora CPTA/ INPA.1. IntroduçãoA primeira grande investigação do potencial de fungos do filo Basidiomycota como agentesprodutores de antimicrobianos foi realizada na década de 40, e observam a atividadeantimicrobiana de extratos de basidiomas e culturas de micélios de aproximadamente 2000espécies desse filo (Rosa et aI., 2003). A espécie Flammulina velutipes (Curtis) Singer, produzdiversos compostos com propriedades medicinais (Badalyan et aI., 2006). Em 2000 e 2001,Ishikawa e colaboradores isolaram e elucidaram a estrutura química de quatro compostosantimicrobianos acumulados na cultura micelial de F. velutipes, descobrindo assim um novo grupode antimicrobianos, chamados Enokipodins A, B, C e D. Em 2005 Ishikawa et aI. observaram aprodução destes compostos a partir de 30 dias de incubação utilizando o meio Caldo de Malte ePeptona. Enokipodins A, B, C e D apresentam interessante configuração química que levou váriosgrupos a sintetizá-los (Kuwahara & Saito, 2004; Srikrishna & Rao, 2004; Secci et aI., 2007). Poroutro lado em pesquisas de biossíntese relata-se a influência da composição do meio, condiçõesambientais e variabilidade genética (Ishikawa et aI., 2005; Meio et aI., 2009). Em experimentoanterior, Meio et aI. (2009), observaram o aumento da produção de metabólitos antimicrobianospor F. velutipes no Meio Completo de Pontecorvo (Pontecorvo et aI., 1953), embora a produção debiomassa tenha sido inferior neste meio quando comparado ao obtido em outros meios de cultura.Este resultado gerou questionamentos quanto ao papel de cada componente deste meio de cultura.Sabe-se que a presença de vitaminas é requerida em pequenas quantidades e são fundamentaispara o desenvolvimento e regulação da síntese de metabólitos secundários.Deste modo este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da exclusão de vitaminas do MeioCompleto de Pontecorvo (MC) na biossíntese dos metabólitos antimicrobianos produzidos pelacultura micelia I de F. velutipes.2. Material e métodosO micélio da cultura estoque de F. velutipes foi cultivado a 25 °C em placa de Petri contendo meioBatata Dextrose Ágar (BDA), após 7 dias foram retirados discos de micélio (9 mm de diâmetro) eusados como inóculo dos experimentos. O MC foi utilizado como controle.Tabela 1. Meio Completo de Pontecorvo et aI. (1953).Reagentes QuantidadeNaN03 6 9KH2P04 1,5 9KCI 0,5 9MgS04 7H20 0,5 9FeS04 0,01 9ZnS04 0,01 9Glicose 10 9Ágar 15 9Água destilada 1000mLPeptona 2 9Caseína hidrolisada 1,5 9Extrato de levedura 0,5 9Solução de vitaminas* 1 mL*Solução de vitaminas Ác. nitotínico 100 mgÁc. P-aminobenzoico 10 mgBiotina 0,2 mgPiridoxina 50 mgRiboflavina 100 mgTiamina 50 mgH20 destilada 100 mLesterilizada734XV!II Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA Manaus - 2009** A solução de vitaminas esterilizada por filtração com membranas com poros de 0,22 prn foi acrescentado nomomento do uso.Os tratamentos foram MC com exclusão das vitaminas. Os respectivos tratamentos foramdistribuídos em frascos de Erlenmeyer de 125 mL, contendo 50 mL cada. Em seguida foramcolocados três discos de inóculo de F. velutipes nos frascos. As condições de incubação foram a 25°C, sem luz, por 15 dias, sem agitação. Após este período, separou-se a biomassa fúngica do meiode cultura por filtração. A massa micelial foi desidratada a 65°C e depois a 105°C até pesoconstante. Os filtrados adquiridos foram submetidos à avaliação da atividade antimicrobiana pelométodo de difusão em Ágar, com base na técnica do pocinho, contra Bacillus subtilis. A atividadeantibacteriana do filtrado da cultura micelial foi determinada pela formação da zona de inibição docrescimento bacteriano, utilizando uma classificação de três níveis.(-) Ausênciadehalo (+) Halo s 0,4 (++) Halo entre 0,41 a (+++) Halo;O:O,610,6Figura 1. Classificação da zona de inibição obtida pelo teste de atividade antimicrobiana pelométodo de difusão em Ágar com base na técnica do poço.3. Resultados e discussãoA produção de biomassa micelial obtida no controle (MC) foi semelhante ao resultado de estudosanteriores (0,15 gjfrasco). Houve crescimento micelial em todos os tratamentos, indicando que aexclusão das vitaminas não interferiu no desenvolvimento micelial de F. velutipes.Tabela 2. Efeito da exclusão de vitaminas do Meio completo de Pontecorvo (MC) no crescimentomicelial e produção de metabólitos antimicrobianos por Flammulina velutipes.Massa micelial Formação de zona deTratamentos (gjfrasco) inibição*MeMe sem BiotinaMe sem Ác.aminobenzóicoMe sem Ácido nicotínicoMe sem TiaminaMe sem RiboflavinaMe sem Piridoxinap-O, 16050 ± 0.03 aO, 14053 ± 0,07 aO, 14783 ± 0,03 a0, 15837 ± 0,04 aO, 16030 ± 0,08 a0, 12020 ± 0,03 aO, 14007 ± 0,05 a++++++++++++* (+) média da zona de inibição $1 mm; (++) média da zona de inibição> 1 mm.(média de 3 repetições)Os filtrados obtidos dos tratamentos com exclusão de Tiamina, Riboflavina, Ác. P-aminobenzóico eÁc. Nicotínico apresentaram maior atividade antimicrobiana contra B. subtilis em relação aocontrole. Por outro lado, o filtrado do tratamento com a exclusão de Piridoxina apresentou resultadonegativo no teste de atividade antimicrobiana e a exclusão de Biotina apresentou resultado similarao obtido no controle. Estes resultados sugerem que a presença das diferentes vitaminas podeestar atuando como o inibidor ou ativador da via biossintética de compostos antimicrobianos comoos enokipodins A-O.735XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAMlINPA Manaus - 2009~OHAMÁ -JQUoMeOB~ ..... ,~.J}R~OOc DFigura 2. Enokipodins A, B, C e D.Os resultados obtidos foram comparados aos de Ishikawa et aI. (2005), que avaliaram o tempo decrescimento micelial e a atividade antibacteriana durante 70 dias de cultivo e verificaram o início daatividade de F. velutipes a partir de 30 dias em Meio Caldo de Malte e Peptona. Em estudosposteriores Meio et aI. (2009), detectaram a produção destes metabólitos a partir de 20 dias deincubação em Meio Completo de Pontecorvo(MC). Os dados obtidos neste trabalho apresentam oinício da atividade antimicrobiana por F.velutipes a partir de 15 dias.4. ConclusãoA biossíntese dos metabólitos antimicrobianos por Flammulina velutipes é influenciada pelapresença ou ausência de vitaminas no Meio Completo de Pontecorvo, embora a produção debiomassa não é afetada significativamente.S. ReferênciasBadalyan, S.M.; Hughes, K.W.; Sakeyan, C.Z.; Helmbrecht, E. 2006. Morphology, growthcharacteristics, and genetic variability of the edible medicinal mushroom Flammulina velutipes(Curt.: Fr) Singer collections. Internatianal Jaurnal af Medicinal Mushroams, 8: 263-278.Ishikawa, N.K.; Yamaji, K.; Tahara, S.; Fukushi, Y.; Takahashi, K. 2000 Highly oxídized cuparene-type sesquiterpenes from mycelial culture of Flammulina velutipes. Phytachemistry, 54: 777-782.Ishikawa, N.K.; Fukushi, Y.; Yamaji, K.; Tahara, S.; Takahashi, K. 2001. Antimicrobial cuparene-type sesquiterpenes, Enokipodins C and D, from a mycelial culture of Flammulina velutipes. Jaurnalot Natural Products, 64: 932-934.Ishikawa, N.K.; Yamaji, K.; Ishimoto, H.; Miura, K.; Fukushi, Y.; Takahashi, K.; Tahara, S. 2005.Production of enokipodins A, B, C and D: a new group of antimicrobial metabolites from mycelialculture of Flammulina velutipes. Mycoscience, 46: 39-45.Kuwahara, S.; Saito, M. 2004. Enantioselective total synthesis of enokipodins A-D. TetrahedronLett., 45:5047-5049.Meio, M.R.; Meirelles, L.D.P.; Faria, T.J.; Ishikawa, N.K. 2009. Influence of Flammulina velutipesmycelia culture conditions on antimicrobial metabolite production. Mycoscience, 50: 78-81.Pontecorvo, G.; Roper, J.A.; Hemons, L.M.; McDonald, K.D.; Bufton,A.W.J. 1953. The gene- tics ofAspergillus nidulans. Adv. Genet, 5:141-238.Rosa, L.H.; Machado, K.M.G.; Jacob, c.c. Campelari, M.; Rosa, C.A.; Zani, CL. 2003. Screening ofBrazilian Basidiomycetes for Antimicrobial Activity. Memórias do Instituto Oswalda Cruz, 98(7):967-974.Srikrishna, A.A.; Rao, M.S. 2004. The first synthesis of the antimicrobial sesquiterpenes (±)-enokipodins A and B. Synlett, 2:374-376.Secci, F.; Frongia, A.; Olliver, J.; Piras, P.P. 2007. Convenient formal synthesis of (±)-enokipodinsA and B, and (±)-cuparene-1, 4-quinone.Synthesis, 7:999-1002.736

Efeito da Exclusão de Vitaminas do Meio Completo de Pontecorvo (mc) No Crescimento Micelial e Produção de Metabólitos Antimicrobianos por Flammulina Velutipes

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