成田 宏夏

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成田, 宏夏

ナリタ, ヒロカ

Chuo University Academic Information Repository / 中央大学学術リポジトリ

図2  F1の回転反応スキームのモデル([13]より改変) A：回転のトラジェクトリの模式図。各 dwell time  (ステップの停止時間)のイベントが示されている。 B：「リン酸先抜けモデル」C：「リン酸後抜けモデル」 F1-ATPaseのP-loop変異体における化学共役スキームの解明 Chemomechanical coupling scheme in F1-ATPase investigated with a P-loop mutant  物理学専攻 成田宏夏  要約  回転分子モーターである F1-ATPaseにおいては、ATP加水分解生成物であるADPとリン酸の解離順序について 2つのモデルが考えられている。2010 年には、それぞれ異なる解離順序を支持する論文[1][2]が報告されており、この結論はまだ確定していない。しかし、野生型 F1 はリン酸解離速度が非常に速いため、直接解離を見ることは困難である。そこで、本研究ではリン酸の解離が遅いP-loop 変異体TF1(βG158A)に着目し、モデルを決めることにした。P-loop変異体の一分子回転観察を行ったところ、ATP加水分解とリン酸解離待ちの角度で長い停止が見られた。野生型とP-loop変異体を用いて作成したハイブリッド F1 についても同様に回転実験を行い、加水分解待ちを含む停止時間の時定数を考察すると、リン酸がADPよりも先に解離する共役スキームであることを示唆する結果を得た。  導入  生命体の細胞中では、化学変化による自由エネルギー差を使って力学的な運動をするタンパク質でできた分子モーターが多く存在しており、それらは生命活動において重要な役割を担っている。FoF1-ATP合成酵素（図1 左）は、ほとんどの生物の生体膜上に存在する膜タンパク質であり、プロトンの流れで放出される電気化学ポテンシャル差と ATP合成の化学ポテンシャルを可逆的に共役するイオン ポンプとして注目されている。構造的には、膜内在性のFo 部分（a1b2c10~13）[3]と膜から突き出たF1部分(α3β3γδε)からなって おり、F1部分を取り出すと単独で ATP 加水分解活性を示すことから、F1-ATPaseとも呼ばれる。さらに、δ、εサブユニットがなくても活性を示すので、α3β3γ複合体をF1（図1 右）と呼び、本研究で扱っている。  これまで、F1について、3つの触媒部位βサブユニットはそれぞれ反応位相を 120°ずらして、共同的に γ サブユニットを一方向にステップ状回転させていることが分かっている。[4]そして、ATP加水分解の各反応素過程（図2 A）が起きるときの γサブユニットの向き（反応角度）と 120°ステップについては、ATP結合、ADP解離により80°のサブステップが引き起こされ、ATP加水分解とリン酸解離により40°のサブステップが引き起こされることが明らかになった。1 つの β サブユニットに ATP が結合したときの反応角度を0°(γ=0°)とすると、γサブユニットが0°で結合したATPは γサブユニットが 120°ステップしたのち ADP とリン酸に加水分解（γ= 200°）され、その生成物であるADPはさらに40°ステップしたのち触媒部位から解離（γ= 240°）する。[5]-[12] 図1 左がFoF1-ATP合成酵素、右がF1-ATPaseの模式図。   しかし、もう一つの生成物であるリン酸の解離の角度については、ADP とリン酸解離の順序の違いで現在 2 つのモデル[13]（図2 B、C）が考えられている。一つ目はATPが加水分解された後に生成物のADPよりも先にリン酸が解離する「リン酸先抜けモデル」（図2 B）と、もう一つは、生成物のADPよりも後にリン酸が解離する「リン酸後抜けモデル」（図2 C）と呼ばれている。リン酸の解離速度が~1000 s-1と非常に速いため計測することが困難であり、スキームを定義できなかった。そこで、我々はリン酸の解離が遅い変異体を用いた F1の 3つの βサブユニットのうち 1つを変異体にしたハイブリッド F1 の回転を解析することで、変異体のリン酸が抜ける角度を特定することでリン酸解離角度を明らかにしようと試みた。  P-loop変異体 我々はリン酸解離を遅くする変異導入場所として β サブユニットの P-loop 構造（156GGAGVG161）に着目した。Bandyopadhyayら[10]によるP-loop変異体TF1(βG158C)の調査によると、加水分解活性が下がることは分かった。これについて、我々は活性の低下原因はリン酸解離が遅くなったためであると考えた。また P-loopの構造は ATP を取り囲むような構造をしていることからもリン酸の結合解離に関与していると予想した。さらに、先行研究[14]によって一分子回転観察ができる 158番目のGlyをAlaに変異させたTF1(βG158A)変異体の活性を調査した結果、野生型の 1/2.6まで低下することが報告されているので、この変異体G158Aを用いることにした。          実験方法  全反射蛍光顕微鏡を用いて一分子観察を行った。数ミリ秒程度の反応速度定数を求めるために、目印として、直径40nmの金コロイド粒子を利用した。F1はα3β3リングに導入したHis-tagを利用してNi-NTAガラス上に固定する。γサブユニット先端に変異導入したCysをビオチンで修飾させ、アビジンで修飾した金コロイド粒子をγサブユニットにビオチン-アビジン結合させる。均一強度のレーザー光を試料面（チェンバー）で全反射させることで発生するエバネッセント場に照射された金コロイドの散乱光の重心解析を行い、dwell time(ステップの待ち時間)のヒストグラムをフィッティングした式から時定数を求め反応の速さを調べた。  一分子回転観察は高濃度ATP(5 mM)条件下で行い、ATP加水分解と図3 野生型とP-loop変異体の結晶構造（PDB；4XD7、[15]より参考） (a)は野生型TF1、(b)はP-loop変異体TF1(βG158A)の構造。それぞれ、青色がβサブユニット、黄色はP-loop構造を示しており、ADP存在下。 図4 全反射顕微鏡の光学系（[16]より改変） リン酸解離の反応速度定数を求めた。次にハイブリッドF1を作成し、同様に回転観察を行い変異体のリン酸解離待ちの反応角度を調べた。  実験結果 F1がステップ回転する際の停止時間(dwell time)のヒストグラムをフィッティングすることで反応の時定数を求めた。ATP飽和濃度(5 mM)の場合、dwell timeは律速段階がATPの加水分解とリン酸の解離と2段階あるのでの二次の指数関数でフィッティングすることで2つの時定数を得られる。               結果を見るとばらつきはあるがG158Aの2つの時定数は野生型と比較して明らかに長くなっているため、G158AはATP加水分解・リン酸の解離共に野生型に比べて遅いことが分かった。よって、G158Aを用いたハイブリッドF1を作成し、ATP飽和濃度で回転観察することでF1の回転反応スキームを決定できる期待が高まった。  次にハイブリッドF1の回転観察を行ったところα3β2β(G158A)γの結果を得ることができた。（図6）                図5 野生型WTと変異体 G158Aの比較 (a)野生型WT、(b)変異体G158Aのdwell timeのヒストグラム。囲みはdwell timeのヒストグラムから得られた時定数、Nは粒子数。ヒストグラムは次の式でフィッティングした。𝒚 = 𝑪(𝒆−𝒕/𝝉𝟏 − 𝒆−𝒕/𝝉𝟐) , 𝜏1,𝜏2=𝜏ℎ𝑦𝑑, 𝜏𝑃𝑟𝑒𝑙 図6 ハイブリッドF1の結果 (a)金コロイドの重心分布解析図 (b) トラジェクトリ  (c)停止角度のヒストグラム  (d)dwell timeのヒストグラム (e)ハイブリッドF1、WT、G158Aのそれぞれのdwell timeから得た時定数の平均値の比較。Nは粒子数。  明らかに、1回転ごとに長いdwellが一回起こっていることが分かる。そのdwellをDwell 1とし、その他の2つのdwellを順にDwell 2、Dwell 3とした。WTとG158Aとの結果も合わせて、各dwell timeのヒストグラムから求めた時定数をまとめた。Dwell1はG158Aの時定数にあてはまることから、Dwell 1はハイブリッドF1の変異の触媒部位β(G158A)で反応していることが考えられる。また、Dwell 2、Dwell 3はWTの時定数であることからWTの触媒部位β(WT)で反応していると考えられる。したがって、このハイブリッドF1について回転反応スキームを考えていき、検証していく。  結論  まず、Dwell 1について考えていく。γが0°でATPがβ(G158A)に結合すると、200°で加水分解し、240°で生成物のADPは解離する。ここで、200°で起こるリン酸解離待ちは、「リン酸先抜けモデル」だと加水分解待ちと同じ触媒部位β(G158A)で起こる一方で、「リン酸後抜けモデル」だと加水分解待ちとは別の触媒部位β(WT)で起こる。今回の実験より、200°における2つの反応待ちはβ(G158A)で起きていると考えられるため、「リン酸先抜けモデル」に当てはまる。  次に、同様にDwell 2に関して考えていく。時定数をみると320°で起こる2つの反応はどちらも同じ触媒部位β(WT)で起きていると考えられるため、「リン酸先抜けモデル」に当てはまる。  したがって、本研究よりF1はADPよりも先にリン酸が解離する「リン酸先抜けモデル」であることが分かった。  参考文献 [1] Shimo-Kon, R., et.al, Biophys.J, 98, 1227 (2010)  [2] Watanabe, R., et.al, Nat.Chem.Biol., 6, 814 (2010) [3] Steigmiller Graeber, PNAS, 105, 3745 (2008) [4] Noji H et al., Nature, 386, 299 (1997) [5] Boyer et al., Faseb, 3, 2164 (1989) [6] Adachi, K et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 7243 (2000) [7] Hirono-Hara, Y., et.al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 13649 (2001) [8] Kinoshita, K., Jr., et.al, Annu. Rev. Biophys. Biomol Struct, 33, 245 (2004) [9] Nishizaka, T., et.al, Nat. Struct. Mol, 11, 142 (2004) [10] Shimabukuro, K., et.al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 14731 (2003) [11] Yasuda, R., et.al, Cell, 93, 1117 (1998) [12] Yasuda, R., et.al, Nature, 410, 898 (2001 [13] Adachi, K., et.al, Cell, 130, 309 (2007) [14] 星名仁志、2014年修士論文 [15]Shirakihara, Y., et al, FEBS J, 15, 2895 (2015) [16] Ueno, H., et.al, Biophys J, 98, 2014 (2010) 図7  ハイブリッドF1の回転反応スキーム ([13]より改変) A：回転のトラジェクトリの模式図。各 dwell timeのイベントが示されている。 B：「リン酸先抜けモデル」 C：「リン酸後抜けモデル」 橙色が変異導入したG158Aの触媒部位での反応（Dwell 1）、緑色がWTの触媒部位での反応（Dwell 2）、青色がWTの触媒部位での反応（Dwell 3）を表している。 

Chemomechanical coupling scheme in F1-ATPase investigated with a P-loop mutant

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F1-ATPaseのP-loop変異体における化学力学共役スキームの解明

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