Syntheses of a phosphoramidite reagent for 5'-phosphorylation of oligonucleotides, and of a modified solid-phase support (controlled pore glass, CPG) for 3'-phosphate modification of oligonucleotides are described. Efficasy of the reagents has been confirmed by the synthesis of phosphorylated oligonucleotides. The oligonucleotides have been analyzed by electrophoresis and HPLC.Описан синтез амидофосфитного реагента для получения олигонуклеотидов, модифицированных по 5 '-положению остатком фосфорной кислоты, а также синтез твердофазного носителя (стекла с контролируемым размером пор, CPG), предназначенного для получения 3'-фосфорилированных олигонуклеотидов. Эффективность реагентов подтверждена синтезом фосфорилированных олигонуклеотидов, которые проанализированы с помощью электрофореза и ВЭЖХ

A. R. Nabiullin

M. V. Kvach

M. Yu. Tatulchenkov

А. Р. Набиуллин

М. В. Квач

М. Ю. Татульченков

Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Chemical Series / Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия химических наук

70ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 3 2014СЕРЫЯ ХІМІЧНЫХ НАВУКУДК 542.06; 577.113.6М. Ю. ТАТУЛьчЕнКОВ, А. Р. нАБИУЛЛИн, М. В. КВАчАМИДОФОСФИТНЫЙ РЕАГЕНТ И ТВЕРДОФАЗНЫЙ НОСИТЕЛЬ ДЛЯ СИНТЕЗА  5R- И 3R-ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВИнститут физико-органической химии нАн Беларуси(Поступила в редакцию 30.12.2013)Нуклеиновые кислоты, содержащие 5R-концевую фосфатную группу, применяются в молеку-лярной биологии при проведении лигазной цепной реакции [1], а также в генной инженерии и других приложениях [2, 3]. Для их получения используется фосфорилирование олигонуклео-тидов Т4-полинуклеотидкиназой [4], однако более распространными являются химические ме-тоды, поскольку они дешевле и проще в применении.Фосфорилированные олигонуклеотиды могут быть получены в условиях автоматического твердофазного синтеза в ДНК-синтезаторе. Для введения модификации по 5R-положению ис-пользуют амидофосфитные реагенты, синтез которых описан в работах [5, 6]. Для введения мет-ки в 3R-положение олигонуклеотидной цепи применяют модифицированный твердофазный но-ситель, получение которого в литературе не описано.В данной работе мы приводим синтез амидофосфитного реагента и твердофазного носителя, позволяющих проводить 5R- и 3R-фосфорилирование олигонуклеотидов в автоматизированном режиме.Экспериментальная часть. В работе использовали бис-(2-гидроксиэтил)сульфид (Aldrich), пергидроль (ГОСТ 177–88), N,N-диизопропилэтиламин (Fluka), 4,4’-диметокситритилхлорид (GL-biochem), LCAA-CPG (long chain aminoalkyl controlled pore glass, Pierce, 500Å, 80 мкмоль/г аминогрупп). Растворители очищали перегонкой. (N,N-диизопропиламино)-(2-цианоэтокси)хлорфосфин синтезирован по ранее описанной методике [7]. За ходом реакций следили с помо-щью ТСХ на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck); пятна визуализировали при помощи ультра-фиолета, паров иода, водного раствора перманганата калия и паров трифторуксусной кислоты. Для колоночной хроматографии использовали силикагель Kieselgel 60 (Merck), размер частиц 40–63 мкм. Спектры ЯМР регистрировали при 500 МГц (1H) и 202,4 МГц (31P) на спектрометре Bruker AC-500. Спектры калиброваны по остаточным сигналам протонов растворителя, химиче-ские сдвиги приведены относительно SiMe4 (1H) и 85 % aq. H3PO4 (31P). Олигонуклеотидный синтез проводили на приборе BiosSet ASM-800 в масштабе 200 нмоль по стандартным протоко-лам изготовителя.Бис-(2-гидроксиэтил)сульфон (1). Бис-(2-гидроксиэтил)сульфид (15 г, 0,123 моль) растворя-ли в ледяной уксусной кислоте (110 мл). Раствор охлаждали до 0 °С, и при перемешивании при-бавляли 30%-ный раствор пероксида водорода (48 мл, 0,492 моль). Смесь нагревали до 80 °С и выдерживали при этой температуре 2,5 ч, после чего добавляли 15 мл уксусного альдегида для удаления избытка перекиси. Растворители упаривали на роторном испарителе, в результате чего получена бесцветная маслянистая жидкость, из которой выделено вещество 1 при помощи коло-ночной хроматографии. Получили 5,04 г сульфона 1 (27 %), представляющего собой бесцветные кристаллы. 1H ЯМР (CDCl3): δ 4,13 (t, 4H), 3,37 (t, 4H).2-((2-(4,4’-диметокситритилокси)этил)сульфонил)этанол (2). Cульфон 1 (4,63 г, 0,03 моль) растворяли в пиридине (65 мл), и при перемешивании прибавляли 4,4’-диметокситритилхлорид 71(7,40 г, 0,022 моль). Смесь перемешивали в течение 18 ч, после чего раствор упаривали на ротор-ном испарителе. Остаток разбавляли этилацетатом (180 мл) и промывали насыщенными раство-рами NaHCO3 (180 мл) и NaCl (180 мл). Сушили безводным сульфатом натрия, раствор упарива-ли, а остаток хроматографировали, элюируя градиентом метанола (0 º 3 %) в хлороформе с до-бавлением 1 % триэтиламина. В результате выделили 6,15 г густого маслянистого вещества 2 (61,7 %), имеющего слабую желтоватую окраску. 1H ЯМР (CDCl3): δ 7,42–7,38 (m, 2H) 7,33–7,27 (m, 6H), 7,25–7,21 (m, 1H), 6,87–6,82 (m, 4H), 4,12–4,08 (m, 2H), 3,79 (m, 6H), 3,67 (t, 2H), 3,38 (t, 2H), 3,19 (t, 2H).(2-((2-(4,4’-диметокситритилокси)этил)сульфонил)этил)-(2-цианоэтил)диизопропилфос-форамидит (3). Спирт 2 (0,912 г, 2 ммоль) растворяли в CH2Cl2 (5 мл), при 0 °С прибавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,376 мл, 2,2 ммоль) и (N,N-диизопропиламино)-(2-цианоэтокси)хлорфосфин (0,52 г, 2,2 ммоль). Раствор нагревали до комнатной температуры, перемешивали 10 мин, разбавляли CH2Cl2 (20 мл) и промывали насыщенными растворами NaHCO3 (10 мл) и NaCl (2 ç 10 мл). Сушили безводным сульфатом натрия и упаривали на роторном испарителе. Остаток растворяли в небольшом объеме (5 мл) толуола и осаждали в гексан. Раствор декантиро-вали, продукт растворяли в хлористом метилене и упаривали досуха. Получили 1,11 г целевого амидофосфита 3 (84,6 %). 1H ЯМР (CD3CN): δ 7,46–7,41 (m, 2H), 7,34–7,28 (m, 6H), 7,26–7,21 (m, 1H), 6,90–6,84 (m, 4H), 4,07–3,96 (m, 2H), 3,85–3,73 (m, 8H), 3,66–3,57 (m, 2H), 3,48–3,30 (m, 6H), 2,62 (t, 2H), 1,18 (d, 6H), 1,16 (d, 6H). 31P ЯМР (CD3CN): δ 148,4.Твердофазный носитель (4). Твердофазный носитель LCAA-CPG (2 г), содержащий первич-ные аминогруппы, обрабатывали 3%-ным раствором трифторуксусной кислоты в CH2Cl2 (20 мл) в течение 4 ч, отфильтровывали, промывали смесью Et3N/DIРEA 9 : 1 (10 мл) и сушили в ваку-уме. Активированный носитель суспендировали в пиридине (67 мл) и добавляли п-N,N-диметил-аминопиридин (ДМАП) (0,54 г, 4,4 ммоль) и янтарный ангидрид (2 г, 20 ммоль). Смесь выдержи-вали 48 ч, отфильтровывали, промывали пиридином (50 мл), ацетонитрилом (50 мл), CH2Cl2 (50 мл) и эфиром (50 мл), сушили в вакууме. Получили носитель, содержащий карбоксильные группы (LCAA-CPG-CO2H).Данный носитель (0,88 г) суспендировали в смеси ДМФ/пиридин (5/5 мл), добавляли сульфон (2) (0,3 г, 0,66 ммоль), ДМАП (53 мг, 0,43 ммоль) и диизопропилкарбодиимид (741 мкл, 4,74 ммоль). Смесь выдерживали 72 ч, добавляли 0,26 г пентафторфенола и оставляли на ночь. Носитель от-фильтровывали, промывали CHCl3 (20 мл) и суспендировали в растворе пиперидина (450 мкл) в пи-ридине (9 мл). Выдерживали 5 мин, отфильтровывали, промывали пиридином (50 мл), метанолом (50 мл), ацетонитрилом (50 мл), CH2Cl2 (50 мл) и эфиром (50 мл), сушили в вакууме.По поглощению диметокситритил-катиона в растворе дихлоруксусной кислоты в CH2Cl2 при 505 нм (коэффициент экстинкции 76 000 л · см–1 · моль–1) определяли загрузку полученного твердо-фазного носителя 4, которая составила 23 мкмоль/г.Олигонуклеотидный синтез проводили в автоматическом режиме с использованием стан-дартных амидофосфитов по протоколам изготовителя прибора. Конденсацию терминального амидофосфита 3 проводили в течение 7,5 мин. Отщепление олигонуклеотида от носителя и де-блокирование осуществляли концентрированным аммиаком (28 %, 0,75 мл). Электрофорез мо-дифицированных олигонуклеотидов проводили в 20%-ном денатурирующем (7 М мочевина) по-лиакриламидном геле.Результаты и их обсуждение. В качестве синтетического блока для получения амидофосфит-ного реагента и твердофазного носителя, с помощью которых осуществляется химическое фосфо-рилирование олигонуклеотидов, можно использовать универсальный реагент бис-(2-гидрокси-этил)сульфон. Производные этого соединения стабильны на всех стадиях процесса олигонукле-отидного синтеза, но они достаточно лабильны в основной среде, что связано с образованием стабилизированного карбаниона при атоме серы и протекающим далее бета-элиминированием. Это свойство позволяет проводить деблокирование продукта олигонуклеотидного синтеза кон-центрированным водным раствором аммиака с образованием фосфатной группы по 5R- или 3R-положению.72Целевой бис-(2-гидроксиэтил)сульфон может быть получен из доступного бис-(2-гидрокси-этил)сульфида окислением перекисью водорода. Нами установлено, что основными побочными продуктами реакции являются моно- и диацетат, которые удалось отделить колоночной хрома-тографией.Диметокситритилирование вещества (1) проводили при недостатке 4,4R-диметокситритил-хлорида, что обеспечивало минимальное образование побочного бис-продукта. При помощи ко-лоночной хроматографии монотритилированный продукт (2) легко отделяется от исходного сое-динения и продукта дитритилирования.Превращение полученного реагента (2) в твердофазный носитель (4) и амидофосфитный реа-гент (3) осуществлено по схеме, представленной на рис. 1.Рис. 1. Схема синтеза амидофосфитного реагента (3) и твердофазного носителя (4) и их использование для 3R- и 5R-фосфорилирования олигонуклеотидовПолученный амидофосфитный реагент (3) и твердофазный носитель (4) протестированы в условиях автоматического олигонуклеотидного синтеза. С помощью этих реагентов были син-тезированы олигонуклеотиды разного состава (таблица).Структура олигонуклеотидов, полученных с использованием синтезированных реагентов  (р – остаток фосфорной кислоты, Т – тимидин)Название Последовательность, 5R → 3R Выход, % (ВЭЖХ)ON1 TTTTTTTTTT 82ON2 TTTTTTTTTTp 96ON3 pTTTTTTTTTT 75ON4 pTTTTTTTTTTp 90Оценка чистоты продуктов олигонуклеотидного синтеза осуществлена с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 2). Как и следовало ожидать, олигонуклеотиды ON1-ON4 обладают различной электрофоретической подвижно-стью, причем нефосфорилированный олигонуклеотид ON1 наименее подвижен; фосфорилированный с обоих концов ON4 имеет максимальную подвижность, а монофосфорилирован-ные олигонуклеотиды ON2 и ON3 по подвижности примерно одинаковы. Это можно объяснить увеличением заряда олиго-нуклеотида при введении каждой дополнительной фосфатной группы, что оказывает более существенное влияние на под-вижность, чем незначительное увеличение молекулярной массы.Хроматографический анализ продуктов олигонуклеотидного синтеза проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С-18 в градиенте ацетонитрила от 0 до 15 % за 30 мин со скоростью 1 мл/мин. В результате анализа установлено, что все четыре олигонуклеотида по-лучены с удовлетворительным выходом (результаты представлены в таблице).Таким образом, синтезированы и испытаны реагенты для получения в условиях автоматиче-ского твердофазного синтеза олигонуклеотидов, фосфорилированных по 5R- и 3R-положениям.Литература1. Barany F. // Genome res. 1991. Vol. 1. N 1. Р. 5–16.2. Modrich P., Lehman I. R. // J. Biol.Chem. 1973. Vol. 248. N 21. Р. 7502–7511.3. Fritz H.-J. DNA Cloning: A Practical Approach : in 2 volumes / H.-J. Fritz. Oxford : IRL Press, 1985. Vol. 1. P. 151–163.4. Van Houten V. et al. // Analytical Biochemistry. 1998. Vol. 265. N 2. P. 386–389.5. Horn T., Urdea M. S. // Tetrahedron Lett. 1986. Vol. 27. N 39. Р. 4705–4708.6. Guzaev A. et al. // Tetrahedron. 1995. Vol. 51. N 34. Р. 9375–9384.7. Bannwarth W., Trzeciak A. // Helv. Chim. Acta. 1987. Vol. 70. N 1. Р. 175–186.M. Yu. TATULCHENKOV, A. R. NABIULLIN, M. V. KVACHPHOSPHORAMIDITE REAGENT AND SOLID-PHASE SUPPORT FOR  SYNTHESIS  OF 5R- AND 3R-PHOSPHORYLATED OLIGONUCLEOTIDESSummarySyntheses of a phosphoramidite reagent for 5R-phosphorylation of oligonucleotides, and of a modified solid-phase support (controlled pore glass, CPG) for 3R-phosphate modification of oligonucleotides are described. Efficasy of the reagents has been confirmed by the synthesis of phosphorylated oligonucleotides. The oligonucleotides have been analyzed by electrophoresis and HPLC.Рис. 2. Электрофорез модифициро-ванных олигонуклеотидов (подписи соответствуют данным таблицы)

Амидофосфитный реагент и твердофазный носитель для синтеза 5'- и З'-фосфорилированных олигонуклеотидов

https://vestichem.belnauka.by/jour/article/download/55/55

Амидофосфитный реагент и твердофазный носитель для синтеза 5'- и З'-фосфорилированных олигонуклеотидов

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Chemical Series / Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия химических наук