De los extractos de corteza y madera de Rollinia pittieri se aislaron e identificaron, cuatro alcaloides, dos con núcleo oxoaporfinico: Ometilmoschatolina 1, Liriodenina 2 y dos con núcleo Nor-aporfínico como la Anonaina 3 y la Nornuciferina 4. El proceso de aislamiento y purificación de todos los alcaloides obtenidos fue llevado a cabo mediante la aplicación de diferentes técnicas cromatográficas (CC, CCD y CCDP). La elucidación estructural se realizó mediante la utilización de técnicas espectroscópicas tales como IR, UV, RMN-1H, RMN-13C mono y bidimensional y EM, así como también por comparación con muestras auténticas. A los extractos clorofórmicos obtenidos de corteza y madera, se les realizó la evaluación de la actividad antioxidante, utilizando la metodología del DPPH, obteniéndose una buena capacidad captadora de radicales libres para los extractos ensayados

Angulo, Alberto

Doria, Maria

Santafe, Gilmar

Torres, Omar

Villa, Hiltony

Zuluaga, Juan

Spanish

Universidad Tecnológica de Pereira: Open Journal Systems

Scientia et Technica Año XIII, No 33, Mayo de 2007. UTP. ISSN 0122-1701                                                                                                                     333       Fecha de Recepción: 15 Febrero de 2007 Fecha de Aceptación: 12 Marzo de 2007  OBTENCIÓN DE ALCALOIDES A PARTIR DE CORTEZA Y MADERA DE LA ESPECIE Rollinia pittieri (ANNONACEAE) RESUMEN De los extractos de corteza y madera de Rollinia  pittieri se aislaron e identificaron, cuatro alcaloides, dos con núcleo oxoaporfinico: O-metilmoschatolina 1, Liriodenina 2 y dos con núcleo Nor-aporfínico como la Anonaina 3 y   la  Nornuciferina 4. El proceso de aislamiento y purificación de todos los  alcaloides obtenidos fue llevado a cabo mediante la aplicación de diferentes técnicas cromatográficas (CC, CCD y CCDP). La elucidación estructural se realizó  mediante la utilización de técnicas espectroscópicas tales como IR, UV, RMN-1H, RMN-13C mono y bidimensional y EM, así como también por comparación  con muestras auténticas. A los extractos clorofórmicos obtenidos de corteza y madera, se les realizó la evaluación de la actividad antioxidante, utilizando la metodología del DPPH, obteniéndose una buena capacidad captadora de radicales libres para los extractos ensayados.   PALABRAS CLAVES: Alcaloides, Annonaceae, Aporfínicos, Oxoaporfínicos., Rollinia pittieri, Antioxidantes.  ABSTRACT From the extracts taken from the bark and wood of Rollinia pittieri four alkaloids were isolated and identified, two of them with an oxoaporphine nucleus: O-methylmoschatoline 1, Liriodenine 2 and the other ones with a Nor-aporphíne nucleus like the Anonaine 3 and   the Nornuciferine 4. The isolating and purification process of these alkaloids was carried out through the application of the following spectroscopic techniques (CC, CCD and CCDP). The structural elucidation was done through the use of spectroscopic techniques such as IR, UV, RMN-1H, RMN-13C mono and bi-dimensional, y EM, as well as by  comparisons of authentic samples. Regarding the chloroformic extracts obtained from bark and wood, and the sub-fractions, the evaluation of the antioxidant activity was carried out by using the methodology of DPPH, obtaining a good receptive capacity of free radicals from the assayed extracts.   KEYWORDS: Alkaloids, Annonaceae, Aporphines, Oxo-aporphines Rollinia Pittieri, antioxidant.  OMAR TORRES Lic. en Química y Biología, MsC Profesor  Asistente Universidad de Córdoba omartorres@hispavista.com  GILMAR SANTAFE Lic. en Química. MsC. Ph.D Profesor  Titular Universidad de Córdoba gsantafe@sinu.unicordoba.edu.co.com  ALBERTO ANGULO Lic. en Química y Biología, MsC Candidato a Ph.D Universidad de Córdoba aanguloo@hotmail.com  HILTONY VILLA Químico Farmacéutico Profesor Titular Universidad de Córdoba hilttny@latinmail.com  JUAN ZULUAGA Lic. en Química y Biología, Ms.C Profesor  Asistente Universidad de Córdoba jucasive@hotmail.com  MARIA DORIA Lic. en Química y Biología, Ms.C Profesor  Asistente Universidad de Córdoba mariadoria@sinu.unicordoba.edu.co  1. INTRODUCCIÓN   En género Rollinia  se han encontrado diferentes  tipos de metabolitos secundarios como: acetogeninas, alcaloides, lignanos entre otros [1]. A los alcaloides encontrados  se les ha comprobado diferentes tipos de actividades biológicas como antiagregación plaquetaria, antifúngica, antimicrobiana y citotóxica [2, 3].Las investigaciones de la gran actividad hallada en el género Rollinia  permiten el desarrollo de estudios tendientes a la búsqueda de compuestos naturales con actividad biológica promisoria. El presente estudio describe la presencia de cuatro alcaloides obtenidos de la corteza y madera de Rollinia pittieri: O-metilmoschatolina 1, Liriodenina 2, Anonaina 3 y Nornuciferina 4. Los alcaloides  1 y 2   son oxoaporfínicos. Recientemente de los tallos de Rollinia pittieri se aislaron  2 alcaloides con actividad antioxidante según el método de DPPH entre ellos el compuesto 1 la O-metil-moschatolina, y la Melosmina  un compuesto con núcleo 7,7-dimetil-1,2, 3,9-tetrahidroaporfínico [4]. Los alcaloides 3 y 4 pertenecen al grupo de los Nor- aporfínicos, los cuales se han encontrado que poseen efectos inhibidores de la tirosina fosfatasa en la proteína CD45[5] y actividad antimalárica in vitro [6] y Antifúngica [7].   2. METODOS Y MATERIALES  2.1 Recolección del material vegetal: El material vegetal de corteza y madera fue colectado en la vereda el Reposo en el municipio de Valencia Departamento de Córdoba, Colombia. La identificación botánica como Rollinia pittieri (Annonaceae),  fue realizada por el Scientia et Technica Año XIII, No 33, Mayo de 2007. UTP   334Doctor Álvaro Cogollo del Jardín Botánico “Joaquín Antonio Uribe”. Universidad de Antioquia.  2.2 Extracción y  Aislamiento: El material de corteza y madera seca y molida se sometió a extracciones sucesivas con etanol al 96% mediante el método de maceración en frío. El extracto etanólico  de corteza y madera se le realizó un desengrase con hexano y luego  se hizo la extracción clásica de alcaloides totales, donde el extracto se disuelve en HCl diluido con el fin de obtener los alcaloides totales en forma de sales y extraerlos luego puros en medio básicos con diclorometano. A una porción del extracto de alcaloides totales de la corteza (0.5 g) se le realizó cromatografía en columna (CC) usando sílica-Gel y cloroformo-hexano (9:1) como fase móvil, donde se obtuvieron diez fracciones (F1-F10). La fracción F5 (200 mg) se sometió al proceso de  purificación en cromatografía en capa delgada preparativa (CCDP) empleando el sistema cloroformo-hexano (9:1), purificándose el compuesto 1 (15 mg) y el compuesto 2 (12 mg).  El extracto de alcaloides totales de la madera (1 g) fue fraccionado por cromatografía en columna (CC) en sílica-Gel usando el sistema cloroformo-hexano (8:2), las fracciones reunidas fueron purificada  por cromatografía en columna (CC) y cromatografía en capa delgada preparativa (CCDP) empleando el sistema cloroformo-metanol (98:2) obteniéndose los compuestos 3 (17 mg) y el compuesto 4 (9 mg).  2.3 Ensayo de actividad antioxidante: Para evaluar los extractos de corteza y madera se empleó el ensayo de actividad antioxidante basado en la decoloración del radical DPPH, seguida por espectrofotometría ultravioleta acorde al protocolo propuesto por  Brand-William [8], el ensayo se realizó utilizando concentraciones de 50, 100, 150, 200 y 250 ppm y un blanco del radical.  Este  ensayo se hizo por triplicado finalmente  se evaluó  el porcentaje  de inhibición o decoloración  correspondiente a cada  concentración  de muestra evaluada y lograr  determinar la concentración inhibitoria media (IC50).  3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN  Del extracto etanólico de corteza y madera de la especie Rollinia pittieri fueron aislados e identificados cuatro alcaloides. Los alcaloides aislados corresponden a: O-metilmoschatolina 1, Liriodenina 2, Anonaina 3 y Nornuciferina 4.   El compuesto 1 fue identificado como el alcaloide Oxoaporfinico O-Metilmoschatolina (Figura 1); sólido naranja. En el espectro EIMS se observa un ión molecular en m/z 321, consistente con la fórmula molecular C19H15NO4, da positiva el ensayo de Dragendorff en placa. El espectro IR.: νmax (cm-1), muestra señales  a 1689 (característica del grupo C=O),  1459  y 1380 que son bandas típicas de sistemas aromáticos. El análisis de RMN-1H (CDCl3, 400 MHz) permite establecer la presencia de 15 protones, destacándose las señales características de 4 protones en la región aromática. Así δ: 8.58 (1H, dd, J=7.8 Hz, 1.4 Hz.), δ: 7.55 (1H, ddd, J=7.8 Hz, 7.1 Hz); δ: 7.76 (1H, ddd, J=7.8Hz, 7.1 Hz, 1.4 Hz), δ 9.11 (1H, d, J=8.3); las características espectrales evidencian que los cuatro protones están unidos a un anillo aromático de manera contigua, lo cual se corrobora con el experimento 1H-1H-COSY (Figura 2). También se observan las señales correspondientes a los protones δ: 8.97 (1H, d, J=5.3) y δ: 8.22 (1H, d, J =5.3), que son propias de un sistema de protones acoplados pertenecientes a un sistema AB aromático. Las señales δ: 4.08 (O-CH3, s), δ: 4.18 (O-CH3, s) y δ: 4.10 (O-CH3, s) representan un sistema de nueve protones pertenecientes a tres grupos metoxilos unidos a anillo aromático. El análisis de RMN-13C (CDCl3, 100 MHz) técnica DEPT, permite establecer la presencia de diecinueve átomos de carbono (Tabla 1). El experimento HMQC establece las correlaciones correspondientes a los protones asignados a la estructura con sus respectivos carbonos y con el análisis de la técnica HMBC a dos, tres y cuatro enlaces, se corroboraron las asignaciones hechas a los protones y carbonos presentes en la estructura, específicamente las posiciones de los carbonos de los anillos aromáticos y de los carbonos presentes en los grupos metoxilo (Figura 1). El compuesto 2 identificado como el alcaloide Liriodenina (Figura 1), sólido amarillo, al igual que el compuesto 1 presentó un núcleo Oxoaporfinico, diferenciándose en las sustituciones que se encuentran en las posiciones 1, 2 y 3 del núcleo básico; los resultados de RMN-1H (CDCl3, 400 MHz) muestran la señal δ: 6.37 (2H,s), correspondientes a protones de un grupo metilendioxi ubicado en las posiciones 1 y 2; además se observa la señal para un protón aromático a δ: 7.17 (1H, s) característica el protón ubicado en la posición 3. El análisis espectral de RMN-13C (CDCl3, 100 MHz)  muestra una señal a δ 102.0 característica de un carbono metilénico perteneciente a un grupo metilendioxi (O-CH2-O), que esta ubicado en las posiciones 1 y 2 del núcleo oxoaporfinico, además se observó una señal  para un carbono aromático metínico no oxigenado a δ: 124.3, que a diferencia del compuesto 1, donde este carbono aparece como cuaternario y  mucho más desplazado a campo bajo a δ: 148.4, lo que indica que esta posición está sustituida por un grupo oxigenado como un metoxilo (OCH3) en la posición 3  estas características espectrales permiten establecer la diferencia estructural entre el compuesto 1 y 2, las demás señales se muestran en la Tabla 1. Las correlaciones C-H a dos tres y cuatro enlaces observadas en el espectro HMBC que permiten confirmar las señales asignadas a la estructura  se muestran en la Figura 1. El compuesto 3 se identificó como el alcaloide Anonaina (Figura 2).  El espectro de masas de la sustancia 3 indica un peso molecular de 265 que corresponde a una fórmula C17H15NO2. Presenta máximas de absorción en el UV de Scientia et Technica Año XIII, No 33, Mayo de 2007. U.T.P  3350204060801001200 50 100 150 200 250 300CONCENTRACIÓ N(ppm)% DE INHIBICIÓNExtracto de Madera IC50: 65ppmExtracto de Corteza IC50: 70ppm234, 273, 314 nm característicos de alcaloides Nor- aporfínicos. El espectro IR indica la presencia de bandas típicas del anillo aromático: 2948 y 1560, 1152, 1084, 945 cm-1. Su espectro de RMN-1H (CDCl3, 400 MHz) mostró la presencia de 5 protones aromáticos, dos protones de un grupo metilendioxi y en la región alifática aparecen siete señales características de protones alifáticos. Los acoplamientos de los protones en el anillo B, C y D fueron corroborados con el experimento 1H-1H COSY (Figura 2). El protón 3 pertenece  al anillo A δ: 6.568(1H, s), los protones 4, 5 y 6a  pertenecientes al anillo B δ: 3.02(1H, m), δ: 2.66(1H,m), δ: 3.41(1H, m), 3.04(1H,m), δ: 4.05(1H, m) respectivamente, a su vez los protones en la posición  7 δ: 2.95(1H, m), δ: 2.84 (1H, t),ubicados en el anillo C, los protones 8, 9, 10, 11 δ7.25(1H ,m), δ 7.23(1H ,m); δ 7.31 (1H, m), δ 8.07(1H,d, J: 8 Hz); pertenecen al anillo D de la Nor-aporfina. Además los protones correspondientes al metilendioxi δ 6.08 (1H,d, J: 1.2), δ5.94(1H, d, J: 1.2 Hz) unido al anillo A. El espectro de RMN13C (CDCl3, 100 MHz) y la técnica DEPT 135 mostraron siete carbonos cuaternarios, entre ellos  los carbonos 1 y 2 sustituidos por el grupo metilendioxi. Muestra además la presencia de cuatro grupos metilenos y seis grupos metínicos (Tabla 1). El espectro HMQC permitió observar los carbonos correspondientes  a los protones aromáticos ya identificados, y con la ayuda de la técnica HMBC se logró comprobar las posiciones de los carbonos en cada uno de los anillo y en la estructura general (Figura 2).  La sustancia 4 se identificó como el alcaloide Nornuciferina (Figura 2), el cual se analizó  por las mismas técnicas espectroscópicas empleadas  para la sustancia 3. El espectro de masas indica un peso molécular de 281 para una fórmula  C18H19NO2. El espectro de RMN-1H (CDCl3, 400 MHz)  muestra  en la región aromática señales de los protones 8, 9, 10, 11 a δ 7.31(1H, m), δ 7.23(1H,m),  δ 7.24(1H,m), δ 8.39 (1H, d , J: 7.6Hz), y el protón 3 δ6.65(1H,s). Estas señales presentan  características semejantes  a la propuesta para el núcleo del alcaloide Nor-aporfínico de la sustancia 3 (Tabla 1). A campo alto en la  región  alifática  se observan  señales  a  δ 4.05(1H, m), δ 3.62(2H,dd), δ 3.15 y δ 3.03 (2H,m),  δ 2.82(2H,dd). Además de éstas aparecen  dos señales en la región alifática integrando cada una para tres (3) protones con desplazamiento a δ 3.893 y δ 3.668 ppm, correspondiente a protones de grupos metoxilo unidos a anillos aromáticos, a diferencia  de la sustancia 3 las señales a δ 6.085 y  δ 5.940 ppm; característica de protones presentes en un grupo metilendioxi no aparecen en la sustancia 4. Los acoplamientos típicos de los protones pertenecientes  a  la sustancia 4  fueron similares a la sustancia 3; lo que se comprueba con  el experimento 1H-1H COSY  (Figura 2). El análisis espectral de RMN13C (CDCl3, 100 MHz) y la técnica DEPT mostraron  7 carbonos cuaternarios; dos de los cuales corresponden a sustituciones de grupos metoxilos en los carbonos 1 y 2, muestra además la presencia de dos grupos metilos, tres metilenos y  seis grupos metínicos (Tabla 1). Al igual que la sustancia 3, los espectros de HMQC y HMBC permitieron corroborar  las diferentes asignaciones y posiciones de los carbonos  en cada uno de los anillos (Figura 2).  Evaluación de la actividad antioxidante:.Los resultados  obtenidos muestran un valor de IC50 por debajo de 100 ppm para los extractos de corteza y madera; lo que  se considera una buena actividad antioxidante si se comparan con los estándares empleados en la  industria como el  BTH, BHA y Acido ascórbico.  Esto probablemente esta relacionado con la  presencia  de  compuestos  con buena capacidad  captadora de radicales libres, como  algunos alcaloides y flavonoides ya aislados en esta especie [1,4]. Los valores de IC50 para cada uno de los extractos se muestra en el  Grafico 1.               Figura 1. 1H-1H COSY, HMBC  del Compuesto 1 y 2                        Figura 2. 1H-1H COSY, HMBC  del Compuesto 3 y 4              Gráfico 1. IC50 Para los extractos de corteza y madera. (S)NOHHHHHHOOOH3CH3CH3CA BCD123 4578910111(S)HHHHHHHNH(R)OOABCD123 457891011HHHHHHH3(S)HHHHHHHNH(R)H3COH3COHHHHHABCD123 4578910114 (S)OHHHHHHHNOOA BCD123 457891011HH2 Scientia et Technica Año XIII, No 33, Mayo de 2007. UTP   336 Átomo RMN 13C (ppm) RMN 1H (ppm) J (Hz)  1 .2 3 4 1 .2 3 4 1 2 1 147.3 148.2 142.5 145.7       1a 115.7 108.5 116.1 126.8       1b 122.3 123.5 127.3 127.3       2 156.4 152.1 146.9 152.9       3 148.4 103.5 107.8 111.6  7.17(s) 6.56(s) 6.65(s)   3a 131.1 136.0 126.3 125.1       4 119.1 124.1 28.8 27.2 8.22(d) 7.76(d) 3.02(m) 2.66(m) 2.82(dd) 5.3 5.2 5 119.1 145.2 43.0 42.1 8.97 8.88 3.41(m) 3.04(m) 3.62(dd) 5.3 5.2 6a 145.5 145.7 53.2 55.2   4.00(dd) 4.05(m)   7 182.6 182.7 36.8 35.6   2.95(m) 2.84(d) 3.15, 3.03(m)   7a 131.8 131.6 134.8 134.6       8 128.9 128.6 128.1 128.5 8.58(dd) 8.58(dd) 7.25(m) 7.31(m) 7.8 ,1.4 7.9 ,1.2 9 128.8 128.3 127.5 127.4 7.55(ddd) 7.57(ddd) 7.23(m) 7.23(m) 7.8 7.1 7.8 ,7.4 10 134.3 133.7 127.0 127.7 7.76(ddd) 7.73(ddd) 7.31(m) 7.24(m) 7.8,7.1,1.4 7.9, 7.3, 1.2 11 128.1 127.2 127.0 128.0 9.11(d) 8.63(d) 8.07(d) 8.39(d) 8.3 8.0 11a 134.5 133.1 131.0 131.7       1-O-CH3 60.9   60.2 4.80(s)   3.66(s)   2-O-CH3 61.4   55.9 4.18(s)   3.89(s)   3-O-CH3 61.8    4.10(s)      1,2 O-CH2-O  102.3 100.7   6.36(s) 6.08(d) 5.94(d)    Tabla 1.  Datos RMN 13C, RMN 1H  de los compuestos 1, 2, 3 y 4.  4.  CONCLUSIONES  De los extractos etanólicos  de corteza y madera se aislaron e identificaron  cuatro alcaloides. De la corteza  dos alcaloides oxoaporfinicos denominados O-metilmoschatolina y liriodenina. Este aislado por primer vez en  la especie Rollinia pittieri.  De la madera  fueron aislados dos alcaloides  con núcleo Nor-aporfínico denominado Anonaina y nornuciferina, ambos aislados por primer  vez en la especie Rollinia pittieri. Los alcaloides aislados  son de tipo aporfinoides, núcleo característico de este tipo de compuesto presente en  especies del genero Rollinia, lo que se  constituye en una herramienta  quimicotaxonómica en el  estudio de este género. Cabe  destacar  que la evaluación de la capacidad antioxidante de los extractos  de corteza y madera ensayados frente al radical  libre DPPH, constituyen una información valiosa, ya que  todos mostraron  una buena capacidad captadora de radicales libres, lo que  impulsa a realizar un estudio químico completo de los compuestos de cada uno de estos extractos con el propósito de  identificar las sustancias mas promisorias como antioxidantes naturales.  5.  BIBLIOGRAFÍA  [1] TORRES, A. y VILLA, H. Estudio químico  y obtención  de principios activos  de las especies  Rollinia pittieri (Annonaceae) del Alto sinú. Informe final de Investigación. Universidad de Córdoba. 13-21. 2006. [2] KUO, R, Y., et al.  Antiplatelet activity of N- methoxicarbonyl aporphines from Rollinia mucosa. Phytochemistry, 57, 421-425.   2001.   [3] CHEN, K.S.; Ho, F.R.; Teng, C.M, et al. Antiplatelet and vasorelaxing action of some aporphinoids. Planta Med. 62 (2), 133-136. 1996.  [4] MONTOYA, G. et al. 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Obtención de alcaloides a partir de corteza y madera de la especie rollinia pittieri (annonaceae)

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