Kloetzel, Kurt

Cadernos Espinosanos (E-Journal)

Estudos sobre a causa de morte no tétano. V -  Investigações "in vitro" sobre a respiração aeróbia e anaeróbia de tecidos de camundongos inoculados com toxina tetânica. (Nota Prévia)

Rev. lnst. Med. trop. São Paulo 4(1):29-34, janeiro-fevereiro 1962 CDU 616.981.551-036.88 ESTUDOS SôBRE A CAUSA DE MORTE NO TÉTANO V. Investigações "in vitro" sôbre a respiração aeróbia e anaeróbia de tec.idos de camundongos inoculados com toxina tetânica. (NOTA PRÉVIA) Kurt KLOETZEL (l) RESUMO Foi investigada a respiração aeróbia e anaeróbia "in vitro" de tecidos de camundongo com tétano experimental. Verificou-se que a respiração do diafragma de animais injetados com toxina é sensivelmente menor que nos controles, em atmosfera de 95·% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono. Quanto à respiração aeróbia, o consumo de ox1ge-nio dêste músculo é maior no tétano que nos animais controles e da mesma ordem de grandeza que nos animais não inoculados mas submetidos ao jejum. Ao emprêgo de homogenizados de •. encéfalo não se verificaram diferenças significativas entre animais com tétano e os controles. Diante dêstes dados sugestivos de um bloqueio da glicólise no tétano experi-mental, o autor analisa os resultados proporcionados por experiências conduzidas "in vivo" tanto no homem como no animal, concluindo haver evidência também a êste nível de investigação de um distúrbio no metabolismo dos carboidratos. Estas alterações não parecem, contudo, específicas do tétano. INTRODUÇÃO Em trabalhos anteriores 8 registramos os nossos dados sôbre o tétano humano e expe-rimental, parte de um plano concebido para a elucidação da causa de morte nesta enfer-midade. A pobreza dos dados proporcionados pelo exame anátomo-patológico de indivíduos fa-lecidos de tétano grave e de animais de laboratório sempre nos sugeriram que, tal qual em outras intoxicações, também no té-tano o distúrbio fundamental fosse uma "le-são bioquímica" 13• Certos aspectos clínicos no tétano humano e experimental se asseme-lham aos quadros clínicos da hipoglicemia, da avitaminose B1 , das intoxicações por ex-cesso de oxigênio, cianuretos, estricnina, fluoreto, malonato, iodoacetato e da "Maple syrup disease", moléstia recentemente descri-ta 11• Provàvelmente esta semelhança do té-tano com os envenenq.mentos em muitos de seus aspectos passou desapercebida por apre-sentar o tétano uma particularidade que lhe é própria, um tempo de incubação relativa-mente longo, mesmo o tétano que se segue à injeção de toxina tetânica. Parece-nos, contudo, que PAPPENHEIMER 12 conseguiu re-mover êste obstáculo, com invulgar inteligên-cia, explicando o prolongado tempo de in-cubação no tétano e na difteria à luz da bioquímica. Em tese publicada em 1951, WENSINCK 17 mostrou que era baixo o teor de glicogênio (1) Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - Clinica de Moléstias Tropicais e Infectuosas (Diretor: Prof. J. A. Meira). Médico da Clinica de Moléstias Tropicais e Inrectuosas. 29 KLOETZEL, K. - Estudos sôbre a causa de morte no tétano. V. Investigações «in vitro» sôbre a respiração ae:róbia e anaeróbia de tecidos de camundongos inoculados com toxina tetânica. Rev. Inst. Med. trop. São Paulo 4:29-34, 1962. do músculo no tétano local ou generalizado, mesmo quando o animal era sacrificado no período de incubação. Admitiu existir um distúrbio na síntese do glicogênio no tétano. Pôde também verificar que a glicólise do diafragma bem como a formação de ácido láctico em extratos musculares estavam di-minuídas. Trabalhos posteriores dêste autor e seus colaboradores 19• ~o indicaram a existência de um bloqueio na glicólise anaeróbia, que se evidenciava por um acúmulo de frutosedi-fosfato e se deveria à "função deficiente" do sistema triosefosfatodehidrogenase. Estas ve-rificações foram feitas apenas no tétano lo-cal. Informa WENSINCK 18 ainda que a adi-ção de DPN restituía o poder glicolítico dos extratos de músculo. Decidimos retomar esta trilha abandona-da por WENSINCK e, além de repetir parte de suas experiências, procurar estendê-las ao tétano generalizado e a outros órgãos, o encéfalo sobretudo. MATERIAL E MÉTODOS O animal por nós empregado era o ca-mundongo branco. Os animais utilizados para as experiências da série I e II pesa-vam 25-30 gramas, para as demais expe-riências 15-20 gramas. A toxina tetânica bruta (Instituto Bu-tantã) era injetada debaixo da pele do dor-so, seguindo-se, após tempo de incubação variável com a dose administrada, um téta-no generalizado, cujas características no ca-mundongo já foram por nós descritas 8 • Os animais eram anestesiados com éter e aber-tos após a parada respiratória, quando o coração via de regra ainda batia em ritmo normal. Após pesagem eram os órgãos lavados em solução de Ringer. O encéfalo era subme-tido a homogenização durante dois minutos em solução gelada de Ringer-fosfato ou Ringer-bicarbonato, conforme a experiência planejada. As determinações eram feitas no aparêlho de W ar bug, pelas técnicas habituais 16 • As , determinações aeróbias eram feitas em Rin-ger-fosfato, com potassa cáustica 'ª 4% no 30 compartimento central, as anaeróbias em Ringer-bicarbonato. No primeiro caso, os frascos eram enchidos com ar, no segundo caso eram "lavados" e enchidos com u'a mistura de %% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono. Acrescentava-se glicose para uma concentração final de 0,2% em tôdas as experiências, exceto quando indica-do no quadro. Todos os animais, menos aqueles das duas e~periências da série I, eram alimentados e postos em contacto com água. Por ocasião do sacrifício, todos os animais já apresentavam sintomas de tétano generalizado; somente nas experiências da série II procuramos relacionar a gravidade dos sintomas com os resultados colhidos no aparêlho de W arburg. Os resultados nas figuras 1 e 5 encon-tram-se expressos em função do "pêso fres-co" do órgão. No quadro I os coeficientes referem-se ao consumo de oxigênio ou pro-dução de dióxido de carbono por miligramo 0--- TETANO- Animal alimentado ---- NORMAL-Animal olimentado ~---- NORMAL- 24 \·foros jejum .. ---- NORMAL-48 Horas Jejum ~--·- NORMAL-Animal alimentado 1 200 (com Glir.ose 0.2% ocrece~ ~ todo ao Ringer) 60 120 180 TEMPO {minutos) Fig. 1 - Consumo de oxigênio «in vitro» do diafragma de camundongos normais e inoculados com toxina tetânica ( 40.000 DMM). -+·-·- MÉDIA PARA ANIMAIS NORMAIS ..,._...... TETANO- '3 Horos após inJeçõo 2.00 -o--o- TETANO- 6 Horas após 1n1eçõo .. 30 TEMPO { minutos) •• 60 Fig. 2 - Produção de dióxido de carbono «in vitro» do diafragma de camundongos normais e inoculados com toxina tetânica ( 40.000 DMM). KLOETZEL, K. - Estudos sôbre a causa ele morte r.o tétano. a respiração aeróbia e ana,eróbia de tecidos ele camundongos Rev. Inst. Med. trop. São Paulo 4:29-34, 1962. V. Investig·acões «in ,,itro» sôbre inoculados com toxina tetânica. QUADRO I Respiração «in vitro» de diafragma e encéfalo de camundongos normais e com tétar l experimental por toxina tetânica. Série 1 Experiéncia Tétano - 40.000 DMM Normal - alimentado I Normal "- jejum 24 h. Normal - jejum 48 h. Normal - alimentado ---II Normal Tétano - 40.000 DMM ---III Tétano - 1 DMM Normal ---IV Normal Tétano - 40.000 DMM ---Tétano - 40.000 DMM V Tétano - 5 .. DMM Normal 1 N.0 de 1 animais órgão 9 Diafragma 7 Diafragma 6 Diafragma 6 Diafragma 2 Diafragma 14 Diafragma 8 Diafragma ----10 Diafragma 10 Diafragma 7 Encéfalo 6 Encéfalo 9 Encéfalo 3 Encéfalo 6 Encéfalo Solução utilizada QN' G ·-- '-----"~-·--·- -·· ---Ringer-fosfato 5,3 Ringer-fosfato 3,3 Ringer-fosfato 2,8 Ringer-fosfato 5,0 Ringer-fosfato-glicose 2,1 ---Ringer-bicarbonato-glicose 10,2 Ringer-bicarbonato-glicose 4,4 ------Ringer-bicarbonato-glicose 3,6 Ringer-bicarbonato-glicose 5,0 ---Ringer-fosfato 4,3 Ringer-fosfato 3,9 -- ---Ringer-bicarbonato-glicose 6,5 Ringer-bicarbonato-glicose 5,2 Ringer-bicarbonato-glicose 5,4 de "pêso sêco", tendo êste sido determinado em animais controles, não utilizados para as experiências mas da mesma idade que os lotes usados. ~ TETANO- 40.000 OMM too ---- TETANO- 5 OMM -+- NORMAL_ ioo _ TETANO ____ NORMAL •o o •• TEMPO (miou.tos) Fig. 3 - Produção de dióxido de carbono «in vitro» do diafragma de camundongos normais e inoculados com toxina tetânica (1 DMM). -TETANO IOO ___ NORMAL ___ ... 'º TEMPO lmmutos} Fig. 4 - Consumo de oxigênio «in vitro» de homogenizados de encéfalo de camun-dongos normais e inoculados com toxina tetânica ( 40.000 DMM). 00 3 ..i,,::=----+----+-----+-----j•o=-•~ 30 4~ TEMPO (minutos) Fig. 5 - Produção de dióxido de carbono «in vitro» de homozenizados de encéfalo de camundongos normais e injetados com toxina tetânica (5 DMM e 40.000 DMM). RESULTADOS Os resultados experimentais estão repro-duzidos nas figuras 1 a 5 e no quadro I. DISCUSSÃO E CONCLUSõES Dada a semelhança na respiração aeróbia "in vitro" de diafragmas dos animais ino-culados e dos animais submetidos ao jejum de 48 horas, não nos queremos deter na dis-cussão das experiências da série I. Lembre-31 KLOETZEL, K. - Estudos .sôbre a causa de morte n::i tétano. V. Investigações «in vitro» sôb1·e a respi1·ação aeróbia e anaeróbia de tecidos de camundongos inoculados com toxina tetânica. Rev. Inst. Med. trop. São Paulo 4:29-34, 1962. mos apenas que expenencias anteriores já puseram em evidência que, semelhantemente ao animal em jejum prolongado, também o fígado do camundongo inoculado com 40.000 DMM de toxina sofre considerável depleção de glicogênio 8 • No tocante à respiração anaeróbia, as nos-sas experiências confirmam os achados de WENSINCK & col.17 • 19• 20 , que primeiro apon-taram a redução na glicólise do músculo de animal com tétano. As diferenças entre os · animais injetados e os animais controles são "altamente significativas" para 40.000 DMM de toxina e apenas "significativas" para 1 DMM. Possivelmente isto encontra expli-cação à luz dos dados anteriormente mos-trados 8, isto é, que a dose de 1 DMM é compatível com a sobrevida · do animal se êste pudesse ser convenientemente alimenta-do. Acreditamos que com esta dose baixa o animal não sucumbe do tétano propriamen-te dito. Poderá ser verificado que a glicólise nos animais controles da série III é muito infe-rior aos animais da série II. Os animais usados para esta última série eram mais ve-lhos que os demais, e sabe-se que a propor-ção tecido muscular/tecido tendinoso do dia-fragma muda com a idade. No que diz respeito ao encéfalo, não pu-deram ser apontadas diferenças significati-vas entre os animais normais e os animais doentes. Não sabemos no momento dizer se o tecido nervoso comporta-se diferentemente do músculo ou se apenas foram artificiais as condições experimentais. Dada à difi-culdade em se obter fatias homogêneas de encéfalo é hábito empregar-se homogenizado dêste tecido, o que envolve maior ou menor rofura celular. Mas o encéfalo não precisa necessàriamen-te apresentar os mesmos fenômenos que o músculo, apesar de tratar-se de uma into-xicação grave e extensa que certamente não limita a sua ação ao diafragma. RosEN-THAL & col. 15 já mostraram que a · anoxia determirtada pelo choque hemorrágico irre-versível, pela intoxicação pelo monóxido de carbono e pela parada. circulatória temporá-ria, agressões que se refletem profundamen-te sôbre o metabolismo de diferentes órgãos, no encéfalo não causam destruição de enzi-32 mas respiratórias nem deficiência crítica de coenzirnas. WILHELMI & col.21 igualmente verificaram que o choque hemorrágico não altera o metabolismo "in vitro" do encéfa-lo, acreditando que o mesmo estivesse "me-lhor protegido" da ano:x:ia que outros teci-dos. LE PAGE 9 • 10 mostrou que o encéfalo no choque não apresenta a mesma perda de glicogênio que o fígado ou o músculo, es-tando "bioqüimicamente melhor conservado". Uma doença que lesasse todo o tecido nervoso, isto é, fôsse verdadeiramente neu-rotrópica, deveria refletir-se mesmo '~in vitro" por alterações respiratórias, como nas experiência de RACKER & KABAT 14 com o vírus da poliomielite. Mas talvez só uma parte do encéfalo seja lesado pela toxina tetânica, o bulbo por exemplo. Nestas circunstâncias, não espe, raríamos que as nossas experiências, em que há "diluição" do bulbo com muito maior quantidade de outros tecidos nervosos, pudessem mostrar diferenças dignas de nota. Poderá o bloqueio na glicólise anaeróbia constituir-se em causa de morte? Cabe exa-minar os nossos dados obtidos "in vivo" no camundongo e no homem, à procura de indícios de que não se limitam ao aparelho de W arburg as alterações metabólicas pela toxina tetânica. Dados nossos 8 e de outros autores mos-tram a freqüência com que ocorre a hiper-glicemia no tétano humano, sobretudo o té-tano grave. Esta hiperglicemia acompanha corriqueiramente os distúrbios na oxidação dos carboidratos 5 • O exercício muscular na presença de um bloqueio da glicólise anaeróbia não se deve acompanhar de aumento do ácido láctico. É o que ocorre no tétano segundo alguns autores 2 • 3 e é o que as poucas dosagens por nós efetuadas 8 parecem confirmar. HIMWICH & col.7 mostraram que o ani-mal recém-nascido resiste mais tempo à as-fixia que o animal adulto, em virtude de um acúmulo lento do déficit energético em seu S.N.C. A injeção de inibidores das en-zimas respiratórias, ao bloquear a . anaero-biose do animal, diminui o tempo de sobre-vida à asfixia '6 • Repetimos as condições destas t,xperiências e já mostramos anterior-KLOETZEL, K. - Estudos sôbre a causa de morte no tétano. V. Investigações «in vitro» sôbre a resniracão aeróbia e anaeróbia de tecidos de camundongos inoculados com toxina tetânica. Rev. Inst. :i\'Ied. trop. São Paulo 4:29-34, 1962. mente 8 que o animal inoculado com toxina tetânica resiste menor tempo à respiração em atmosferas pobres em oxigénio que os animais controles. Eis aí mais um indício de que o bloqueio na glicólise tem corres-pondência no vivo. Em um ponto capital, a nosso ver bas-tánte sério, existe divergência entre o con-ceito firmado neste trabalho e a experiên-cia prática. Qualquer distúrbio na utiliza-ção dos carboidratos, suprida pelo acelerado catabolismo das proteínas e das ·groduras, levaria a um acúmulo de corpos cetônicos e aumentaria a excreção urinária de nitrogê-nio. É o que pudemos verificar no tétano humano. Entretanto, tanto a cetonúria como o balanço negativo de nitrogênio puderam ser diminuídos em nossos pacientes desde que a êles fornecêssemos suficiente glicose por via endovenosa 8 • No momento plane-jamos experiências adicionais para o escla-recimento dêste ponto. Os nossos achados não são específicos do tétano. Já mostramos anteriormente 8 que esta doença apresenta pontos em comum com outros tipos de "agressão" no que diz respeito à bioquímica do sangue, ao meta-bolismo basal, ao glicogênio hepático. Nem mesmo o bloqueio da glicólise anaeróbia parece-lhe característica: um bloqueio no metabolismo dos carboidratos no choque foi sugerido por GREEN & STONER 4 e melhor documentado por AMBROSOLI & ScARPIONI 1 • SUMMARY Studies on the cause of death in tetanus. V. "ln vitro" studies on aerobic and anaero-bic respiration in tissues of mice inooulated with tetanus toxin. The "in vitro" respiration of tissues of mice injected with tetanus toxin has been studied. Anaerobic respiration of the diaphragm of injected animais is significantly lower than in the normal animal. As to the aero-bic respiration, it has been found that the oxygen consumption of injected animais is much higher than in the normal diaphragm, and just about as high as the respiration of diaphragms from normal animais starved for 48 hours. No differences have been found between normal and injected animals in aerobic or anaerobic respiration of brain homogeni-zates. Therefore there is presumptive evidence of a block in the metabolic pathway of car-bohydrates, at least in the diaphragm of in-jected animals. These data are compared with the result of "in vivo" investigations carried out previously in mice and in the human, and the conclusion is reached that a biochemical lesion seems to be active also in the alive animal and in our patients. There is evidence that these findings are not specific to tetanus. REFERÊNCIAS 1. AMBROSOLI, S. & SCARPIONI, L. - Sul comportamento dl alcune attivitá enzima-tiche interesate nel ciclo glicolitico in cor-so di shock. Giorn. Clin. med. 39:593-612, 1958. 2. DAVENPORT, H. A.; DAVENPORT, H. K. & RANSON, S. W. - Chemical studies of muscle contracture. I - The lactic acid content. J. biol. Chem. 79:499~505, 1928. 3. DEUTICKE, H. J.; HOLLMANN, S. & SCHAEFFER, H. - üeber den Stoffwechsel des Muskles im Wundstarrkrampf. Pflue-gers Arch. 248:.39-50, 1944. 4. GREEN, H. N. & STONER, H. 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Estudos sobre a causa de morte no tétano.  V - Investigações "in vitro" sobre a respiração aeróbia e anaeróbia de tecidos de camundongos inoculados com toxina tetânica. (Nota Prévia)

Studies on the cause of death in tetanus. V. “In vitro” studies on aerobic and anaerobic respiration in tissues of mice inoculated with tetanus toxin

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