Alegria, Manuela Raquel de Mello e

Ciampi, Ana Yamaguishi

Sujii, Patrícia Sanae

Portuguese

Archives of the Faculty of Veterinary Medicine UFRGS

NOTA CIENTÍFICA Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 5, supl. 1, p. 558-560, jul. 2007   Introdução Trithrinax brasiliensis Mart. (Arecaceae) espécie endêmica da Região Sul do Brasil, ocorre de maneira descontínua, em áreas restritas e isoladas [1]. A espécie é caracterizada por indivíduos com até 10 metros de altura, com folhas palminérvias, com um tufo de pelos no ápice do estirpe, apresentando inflorescências amarelas e frutos carnosos de sabor dulcíssimo. Também conhecido como Palmeira de Buriti é utilizado principalmente para ornamentação e fabricação de chapéus. De acordo com o Conselho Estadual do Meio Ambiente T. brasiliensis encontra-se em risco de extinção [2]. A avaliação da variabilidade genética da espécie é um importante parâmetro para a definição de programas de manejo e conservação de espécies, principalmente para aquelas sob forte pressão antrópica. Um dos métodos de análise genética muito utilizado em estudos populacionais consiste na utilização de marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) [3]. Esta tecnologia utiliza um único iniciador ao invés de um par, e esse iniciador único tem seqüência arbitrária de modo que a seqüência alvo é desconhecida e irrelevante. Os marcadores RAPD se baseiam na amplificação de fragmentos de DNA e é vantajosa pela simplicidade e rapidez a baixos custos. Assim, grande quantidade de polimorfismo e segmentos de DNA são obtidos em curto espaço de tempo. Para que haja a amplificação de um fragmento RAPD duas seqüências de DNA complementares ao iniciador devem estar adjacentes (<4000 pares de base) e em orientação oposta, para permitir a amplificação pela DNA polimerase. A característica importante e desvantajosa, deste tipo de marcador é o seu comportamento como marcador genético dominante [4]. A dominância neste caso não se refere à interação genética entre alelos de um mesmo loco e sim à interpretação relativa entre fenótipo e genótipo. O objetivo desse trabalho consistiu em uma análise de variabilidade genética com uso de marcadores moleculares em duas populações de T. brasiliensis ocorrentes na área de Aproveitamento Hidroelétrico (AHE) de Barra Grande, SC/RS, com vistas à conservação.  Material e métodos A. Material vegetal. Foram coletadas amostras de folhas expandidas adultas e sadias de 50 indivíduos procedentes de 2 populações remanescentes de T. brasiliensis da área de Aproveitamento Hidroelétrico (AHE) de Barra Grande, SC/RS separadas por cinco quilômetros. As duas populações analisadas são caracterizadas por ambientes distintos. Em uma delas os indivíduos de T. brasiliensis se desenvolvem diretamente expostos ao sol, enquanto que na outra à sombra. Amostras de cada população foram coletadas e depositadas no herbário da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CEN).  B. Extração e Quantificação do DNA. A extração foi realizada de acordo com o protocolo de Doyle & Dolye [5], adaptado com o auxilio da máquina Fastprep – BIO 101 SAVANT na trituração das amostras  Após a suspensão do DNA em TE (Tris HCl 10mM , EDTA 1mM),  alíquotas de 2μl de cada amostra de DNA foram quantificadas por eletroforese em gel de agarose 1,0 %  em TBE 1x (Tris Borato), usando quantidades conhecidas de DNA de fago λ: 50, 100, 200 e 400 ng, para estimar a quantidade de DNA de cada indivíduo. A corrente usada foi de 72 V, 38 mA por 1 hora. O DNA foi fotografado para a quantificação e diluição (1 ng/μl) de cada amostra foram preparadas a partir do estoque de cada indivíduo.  C. Seleção de primers e amplificação RAPD. A seleção de iniciadores foi realizado usando duas amostras de cada população testando 176 iniciadores da Operon Tecnology escolhidos ao acaso. Foram selecionados aqueles que apresentaram bandas polimórficas e de melhor intensidade e nitidez quando visualizados em géis de agarose (1,5%) com detecção com brometo de etídio e luz ultra violeta, após a eletroforese a 120 V, por 4 - 5 horas.  A amplificação do DNA foi feita por RAPD uma técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) que utiliza um único primer de cerca de 10 pb. Foram utilizados 3 µl de DNA a 1 ng/µl e 10 µl de um coquetel de reagentes (1,3 μl Tampão 10x + 15 mM MgCl2; 1,04μl  dNTP 2,5 mM; 1,04μl BSA 2,5 mg/ml; 3,0 μl Iniciador 10 ng/μl; 0,2μl  Taq DNA polimerase 5 U/μl e 3,42μl de H2O Milli Q estéril) e sobre a reação foram adicionados 50μl de óleo mineral puro, que impede que a reação evapore quando exposta a altas temperaturas no termociclador. O programa utilizado para essa PCR, consistiu de 41 ciclos (Desnaturação a 92ºC por 1 min, anelamento a 35ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 2 min e um passo final de extensão de 7 min a 72ºC).  As reações foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídio, onde os produtos da amplificação foram separados sob uma voltagem constante de 120 Volts durante 4 horas e 30 minutos. O DNA padrão, com fragmentos de tamanhos conhecidos utilizado foi Ladder 1kb.  A visualização das amplificações de fragmentos de DNA foi realizada com detecção em luz ultravioleta e os resultados foram fotografados por uma câmera acoplada Análise Genética em Populações de Trithrinax brasiliensis Mart. Utilizando Marcadores Moleculares RAPD Ana Yamaguishi Ciampi1, Patrícia Sanae Sujii2 e Manuela Raquel de Mello e Alegria 3  Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 5, supl. 1, p. 558-560, jul. 2007  559 a um sistema computadorizado denominado de Eagle Eye II – Stratagene.   D. Análise dos dados. Em cada reação foram identificadas as bandas polimórficas e anotadas como presença (1) ou ausência (0) do fragmento para cada indivíduo, gerando uma planilha de dados com valores binários, 0 e 1. Esses dados foram utilizados na geração de uma matriz de valores binários. O coeficiente de DICE foi utilizado para estimar similaridade genética de buriti, sendo obtido o dendrograma pelo método da média aritmética não ponderada para agrupamento aos pares (UPGMA-Unweighted Pair Group Arithmetic Average), utilizando-se o programa NTSYS 2.0 – Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis Systems [6].  Resultados e Discussão Da seleção de 176 iniciadores RAPDs, foram escolhidos 24 com maior número de fragmentos polimórficos, como citado por Anzizar et al. [7] na análise de 28 genótipos de diversas espécies da família Arecaceae. Foram gerados 58 marcadores RAPD polimórficos (Fig. 1a, Fig. 1b) bastante confiáveis pela nitidez e reprodutibilidade.  A tecnologia RAPD tem sido utilizada em várias espécies nativas tropicais, pouco conhecidas geneticamente [8,9], no sentido dar suporte aos programas de conservação e coleta de germoplasma vegetal.   Análise de aglomeração hierárquica (Fig. 2) utilizando coeficiente DICE e o método de UPGMA de 47 indivíduos de Trithrinax brasiliensis obtido pelo programa NTSYS evidenciou similaridade aproximada de 60%, não havendo formação de grupos diferenciando as duas populações. Embora os ambientes entre as populações evidenciem diferenças, a similaridade genética entre indivíduos (10 e 48) de diferentes ambientes mostrou alta similaridade (85%), bem como entre indivíduos (8 e 9) do mesmo ambiente (83%). Devido à proximidade entre as duas populações (cinco quilômetros), o fluxo gênico entre os indivíduos desta área deve ocorrer, indicando ser na verdade uma única população remanescente.  Conclusões Uma rápida análise genética permitiu evidenciar a ocorrência da variabilidade genética de 40% da espécie T. brasiliensis da AHE de Barra Grande, SC/RS e sugere uma estratégia de conservação incluindo o máximo de indivíduos, no sentido de salvaguardar maior número de alelos da espécie. No entanto, para o desenvolvimento de estratégias de conservação de alto nível, recomenda-se a realização de estudos utilizando outras técnicas de análise molecular, que possam analisar tal variabilidade, considerando outras seqüências de DNA que não essas aleatórias utilizadas por RAPD, como é o que ocorre com marcadores moleculares microssatélites, com muita informação genética. Essas análises permitiriam estimar a variabilidade genética, analisando fluxo gênico, heterozigosidade, freqüências alélicas e taxas de endogamia, o que forneceria outros resultados para o desenvolvimento de estratégias de conservação e manejo sustentável da espécie T. brasiliensis.  Agradecimentos Os autores agradecem aos coordenadores do projeto Dra. Taciana Barbosa Cavalcanti e Dr. Marcelo Brilhante Medeiros e a equipe de coleta da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia em especial ao Glocimar Pereira da Silva. À Zilneide P.S. Amaral, Elisabete Pereira Nunes e Aécio A. dos Santos pelo auxílio durante as atividades de laboratório e coleta de material no campo. À FUNARBE e BAESA pelo apoio financeiro.   Referências [1] GUBERT, F.A.F. 1987. Descrição de duas áreas de ocorrência natural da Palmácea Trithrinax brasiliensis no estado do Paraná In: Boletim FBCN/Fundação Brasileira para a Conservação da Natureza.Rio de Janeiro: FBCN, 1966. p. 79-88.  [2] Lista Final das Espécies da Flora Ameaçadas-RS Decreto Estadual n 42.099, publicado em 1/01/2003. Homepage:http://www.fzb.rs.gov.br/downloads/flora_ameacada.pdf [3] WILLIAMS, J.G.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A. & TINGEY, S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucl. Acids. Res. 1990 18: 6531-6535.  [4] FERREIRA, M.E. & GRATTAPAGLIA, D. 1998. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3. ed. Brasília: EMBRAPA – CENARGEN. 220p. [5] DOYLE JJ & DOYLE JL. 1987. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12:13-15. [6] ADAMS D, KIM J, JENSEN R, MARCUS L, SLICE DE & WALKER J. 2002. NTSYSpc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, versão 2.10z © by Applied Biostatistics, Inc [7] ANZIZAR, I.; HERRERA, M.; ROHDE, W.; SANTOS, A.; DOWE, J.L.; GOIKOETXEA, P. & RITTER, E. 1998. Journal of the International Association for Plant Taxonomy. v.47(3): 635-645 .  [8] CIAMPI, A.Y. & MAGALHÃES, M.T.Q. 2001. Análise da variabilidade genética de três espécies arbóreas utilizando marcador molecular RAPD. Comunicado técnico, Embrapa Cenargen, Brasília DF, 60: 1-8. [9] CIAMPI, A.Y.; AZEVEDO, V.C.R. & SILVA, V.P. 200.3 Análise genética populacional de Tabebuia impetiginosa utilizando marcadores moleculares RAPD. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 18p. Boletim de Pesquisa e desenvolvimento, 55.  Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 5, supl. 1, p. 558-560, jul. 2007  560      Figura 1. (a) Eletroforese de fragmentos de RAPD (iniciador OPV04) em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo. As setas indicam os marcadores RAPD polimórficos usados na análise. Pista 1 Ladder 1 Kb. As pistas 2 -24 representam os indivíduos de T. brasiliensis. (b) Eletroforese de fragmentos de RAPD (iniciador OPAX03) em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo. As setas indicam os marcadores RAPD polimórficos usados na análise. Pista 1 Ladder 1 Kb. As pistas 2-22 representam os indivíduos de T. brasiliensis.        Figura 2. Análise de aglomeração hierárquica utilizando coeficiente DICE e o método de UPGMA de 47 acessos de Trithrinax brasiliensis baseada na estimativa de similaridade genética computada pela análise de 58 fragmentos de DNA amplificados ao acaso.  

Análise Genética em Populações de Trithrinax brasiliensis Mart. Utilizando Marcadores Moleculares RAPD

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