ANTUNES, C. A.

AZEVEDO, V.

DORELLA, F. A.

GOUVEIA, A. M. G.

GUIMARAES, A. S.

RIBEIRO, D.

SEYFFERT, N.

SILVA, M. X.

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XV Encontro Nacional de Patologia VeterináriaI Congresso Brasileira de Patologia VeterináriaVSimpósio Brasileiro da CLDaV1S Foundation26 a 30 de Setembro de 2011amuo de Convençõe, de Goiània ' 60TESTE INTRADERMICO DE HIPERSENSIBILIDADE PARA DIAGNÓSTICO DALINFADENITECASEOSA SUBCLÍNICA EM CAPRINOSSKIN TEST FOR DIAGNOSIS OF SUBCLINICAL CASEOUS LYMPHADENITIS INGOATSCamila Azevedo Antunes', Alessandro de Sá Guimarães', Dayana Ribeiro3, Fernanda AlvesDorella", Aurora Maria Guimarães Gouveia, Marcos Xavier Silva", Vasco Azevedo", NúbiaSeyffert"L Mestranda. Depto. de Biologia Geral, ICB, UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais. E-mail:azevedoan tu nes, cam ila@gmail,com2. Pesquisador, Sanidade Animal e Qualidade do Leite, Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, Minas Gerais.3,Doutoranda, Depto de Microbiologia, ICB, UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais.4. Pós-Doutoranda, Depto, de Biologia Geral, ICB, UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais,), Professorra), Depto. de Medicina Veterinária e Preventiva, EV, UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais.6. Professor, Depto. de Biologia Geral, ICB, UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais.PALAVRAS - CHAVE: Corynebacterium pseudotuberculosis, pequenos ruminantes,Técnica de fracionamento em três fases.ABSTRACTCaseous lymphadenitis (CLA) is a disease caused by Corynebacteriumpseudotuberculosis that affects small ruminants, decreasing the production in infectedanimaIs. Several methods for detection of subclinicaI CLA have been deveIoped but withoutsuccess. The present study has deveIoped a Skin Test using secreted proteins of C.pseudotuberculosis for subcIinical CLA diagnostic in small ruminants. The tested animaIswere divided into two different groups: 10 positives (A) and 10 negative goats (B) for CLA.The fraction of secreted proteins was obtained through Three-Phase Partitioning (TPP),diIuted in PBS soIution and then inocuIated in the Ieft cervicaI region, via intra-dermal.InocuIation of PBS solution without proteins was performed in the same tested animaIs at theright sicle. Group A showed higher hypersensitivity compared to group B during 6 days of .evaluation, with a peak response after 24 hours. The standarclized Skin Test showedpromising results and might improve CLA controI in herds.\nKEYWORDS:Partitioning.Corynebacterium Three-Phasepseudotuberculosis, small ruminats,INTRODUÇÃOA Linfadenite caseosa (LC) é causada por Corynebacterium pseudotuberculosis eacomete principalmente pequenos ruminantes. Essa doença de importante relevânciaeconômica é caracterizada pela formação de abscessos em nódulos Iinfáticos superficiais e/ouórgãos internos, reduzindo a produtividade dos animais infectados (DORELLA et aI., 2006;SEYFFERT et al., 2010). O tratamento com antibióticos é uma estratégia inviável, uma vezque eles não são capazes de penetrar na cápsula dos abscessos. Quanto à imunoprofilaxia, aelaboração de vacinas mais eficazes torna-se necessária (DORELLA et aI., 2006). Váriosmétodos diagnósticos subclínicos para a LC foram desenvolvidos, mas nenhum deles comresultados promissores e praticidade necessária. Recentemente, proteínas secretadas de C.pseudotuberculosis foram identificadas e caracterizadas por espectrometria de massa eanálises in silico (PACHECO et aI., 2011). Essas mesmas proteínas já haviam demonstradoreatividade com anticorpos de caprinos infectados com C. pseudotuberculosis através deELISA e Western Blot, além de induzirem elevada produção de interferon-gama por célulassanguíneas de caprinos com LC (REBOUÇAS et aI., 2011). Este trabalho tem por objetivopadronizar e avaliar um Teste Tntradérmico de Hipersensibilidade (TIH) com proteínassecretadas de C. pseudotuberculosis para o diagnóstico subclínico da LC em caprinos.MATERIAL E MÉTODOSCento e vinte e oito cabras de leite da raça Saanen foram avaliadas através de examesclínicos e sorológicos, e selecionadas em dois grupos constituídos de 10 animais positivos(grupo A) e 10 negativos (grupo B) para a LC. Paralelamente, para a preparação do reagentedo TIH, a linhagem de C. pseudotuberculosis MIC6 foi cultivada em meio Infusão de cérebroe coração (BHI), as proteínas secretadas foram extraídas através da Técnica de Fracionamentoem Três Fases (TPP) e quantificadas pelo método de Bradford. Posteriormente, o TIH foipadronizado e aplicado nos caprinos por via intradérmica na dose de 0,1mL na região cervicalesquerda em uma área tricotomizada de 4cm2. Nos mesmos animais foi aplicado O,lmL deTris-HCl (pH 8) sem as proteínas secretadas, na região cervical direita para controle doexperimento. As mensurações do TIH foram realizadas com cutímetro Hauptner, antes dainoculação e a cada 24h, nos seis dias subsequentes.RESULTADOS2 3 ~ 5 6 ,__ '..... .'__ ._'___ Di"s avaliarlos IGráfico I - Médias da espessura da dobra depele';;;ltes (Diã-6'j'e ap6saplicaçàoCOias'l=6) do 'TIl-I nos Grupo A(ELlSA positivo) e Grupo B (ELISA negativo), apresentado em barras verdes e vermelhas, respectivamente. Aslinhas verdes e vermelhas correspondern às médias do aumento da espessura da dobra de pele antes (Dia O) eapós aplicação (Dias 1-6) da solução controle nos dois grupos.~'""".g:-i.e, .jtTeste Inrradérmtco de HlperseusthílirladeI- (:RUPO A a:IH) I..-.-.--,--. , C,THfPO B rrrrn !-GRUPO.-\ (ct) !l_GRllPOB (ct) I~ ].«.Os animais do grupo A apresentaram valores do TIH significativamente superioresaos do grupo B em todos os dias avaliados. Nas primeiras 24h houve um pico de reação, commaior evidência do grupo A, declinando até as 72h, com retorno à normalidade após 96h daaplicação do TIH. Todos os controles mantiveram seus valores semelhantes em ambos osgrupos e ao decorrer dos dias avaliados.DISCUSSÃOO Teste Intradérmico de Hipersensibilidade (TlH) é um método de diagnósticoutilizado para verificar infecções causadas por microrganismos intracelulares facultativos comimunidade mediada por células. Esse teste tem vantagens relacionadas a facilidade deaplicação nos animais, a simplicidade de manuseio e um custo final relativamente reduzidocomparando com o interferon gama (DE LA RUA-DOMENECH et al., 2006). Neste trabalhopadronizamos um TIH de proteínas secretadas antigênicas de C. pseudotuberculosis queobteve resultados significativos no grupo de animais positivos para a LC. Constatada anecessidade de purificação do antígeno de C. pseudotuberculosis para o TIR, com a remoçãode componentes citoplasmáticos (BROWN et ai., 1986; AL VES & ORLANDER, 1999), aextração de proteínas secreta das para o TIR permitiu a obtenção de resultados mais eficientes.Além disso, todos os animais apresentaram exame clínico com estado geral e funções vitaisnormais antes e após a aplicação do teste. O THI estimula uma reação de hipersensibilidadetardia (Tipo IV), geralmente sem manifestações sistêrnicas, caracterizada por uma respostainflamatória no local da aplicação do reagente (TIZARD, 2000). A reação do TIH medidapelo aumento da espessura da dobra de pele atingiu mensuração máxima em 24h após ainoculação, mostrando-se concordante com o indicado por Tizard (2000), caracterizado poruma resposta inflamatória que poderia atingir a sua maior intensidade entre 24 e 72 h. Emestudos anteriores, Ó· menor tempo de mensuração máxima foi de 72h (ALVES &OLANDER, 1999). Assim, o presente estudo atingiu a mensuração significativa em apenas 1dia. As mensurações referentes aos testes controles aplicados mantiveram seus valoressemelhantes em ambos os grupos e no decorrer dos dias avaliados, apresentando somente umareação à inoculação mecânica e ao tampão, as quais não foram significativas.CONCLUSÃOAs proteínas secretadas e sua concentração para a utilização no TIH foramdeterminadas, bem como aplicação padronizada em caprinos. O TIH apresentou mens~lraçãomáxima em 24h, não apresentando reatividade significativa dos animais ao teste aplicado semas proteínas secretadas. O TIH padronizado para diagnóstico subclínico da LC em caprinos,demonstrou resultados promissores e será aprimorado para utilização no controle da LC.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASALVES, F. S. F.; OLANDER, H. Uso de Vacina Toxóide no Controle da Linfadenite Caseosa em Caprinos,Journal ofVctcrinary Sciencen, v.S, n.l , p. 69-74,1999.DE LA RUA-DOMENECH, R.; GOODCHILD, A. T.; VORDERMEIER, H. M.; HEWINSON, R. G.;Cl-IRISTIANSEN, K. H.; CLlFTON-HADLEY, R. S. Ante mortern diagnosis oftuberculosis in cattle: A reviewof the tuberculin tests, y-interferon assay and other ancillary diagnostic techniques. Rescarch in VeterinaryScicncc, Oxford, v. 81, p. 190-210,2006.DORELLA, r.A.; PACI-lECO, L.G.c.; OLIVEIRA, S.C; MIYOSHI, A.; AZEVEDO, V. Corynebacteriumpseudontbercnlosis: microbiology, biochernical properties, pathogenesis and molecular studies 01' virulence.Veterinary. Rcscarch, v. 37, p. 201-218, 2006.PACHECO, L.G.C.; SLADE, S.E.; SEYFFERT, N.; SANTOS, A.R.; CASTRO, T.L.P.; SILVA, W.M.;SANTOS, A.V, SANTOS, S.G.; FARIAS, L.M.; CARVALHO, M.A.R.; PIMENTA, A.M.C.; MEYER, R.;SILVA, A.; SCRIVENS, J.H.; OLIVEIRA, S.C.; MIYOSHI, A.; DOWSON, C.G.; AZEVEDO,V. A cornbinedapproach for comparative exoproteorne analysis of Corynebacterium pseudotuberculosls. BMC Microbiology,v. I, p. 1-14,2011.REBOUÇAS, M.F.; PORTELA, R.W.; LIMA, D.D.; LOUREIRO, D.; BASTOS, B.L.; MOURA-COSTA, L.F.;VALE, V.L.; MIYOSHI, A.; AZEVEDO, V.; MEYER, R .. Corynebacterium pseudotuberculosis secretedantigen-induced specific interferon-garnma production by peripheral blood leukocytes: potential diagnosticmarker for caseous lymphadenitis in sheep and goats. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 23, p.1-6,2011.SEYFFERT, N.; GUIMARÃES, A.S.; PACHECO, L.G.C.; PORTELA, R.W.; BASTOS, B.L.; DORELLA,r.A.; I-IETNEMANN, M.B.; LAGE, A.P.; GOUVEIA, A.M.G.; MEYER, R.; MIYOSHI, A.; AZEVEDO, V.I-ligh seroprevalence of caseous Iymphadenitis in Brazilian goat herds revealed by Corynebacteriumpseudotuberculosis secreted proteins-based ELISA. Rcsearch in Veterinary Scicnce, v. 88,50-55,2010.TIZARD, l.R. Veterinary ímmunology. 6.ed. Philadelphia: Saunders, 2000. 482p.

Teste intradérmico de hipersensibilidade para diagnóstico da linfadenite caseosa subclinica em caprinos.

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Teste intradérmico de hipersensibilidade para diagnóstico da linfadenite caseosa subclinica em caprinos.

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