Hoorfar, Jeffrey

Löfström, Charlotta

Norling, Börje

Rådström, Peter

Schelin, Jenny

Vigre, Håkan

Online Research Database In Technology

                       General rights Copyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright owners and it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights.  • Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain • You may freely distribute the URL identifying the publication in the public portal   If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.     Downloaded from orbit.dtu.dk on: Dec 20, 2017Enumeration of Salmonella enterica in naturally contaminated animal feed samples byflotation prior to real-time quantitative PCRSchelin, Jenny; Norling, Börje; Vigre, Håkan; Rådström, Peter; Löfström, CharlottaPublication date:2012Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordLink back to DTU OrbitCitation (APA):Schelin, J., Norling, B., Vigre, H., Rådström, P., & Löfström, C. (2012). Enumeration of Salmonella enterica innaturally contaminated animal feed samples by flotation prior to real-time quantitative PCR. Poster sessionpresented at 23rd International ICFMH Symposium, FoodMicro 2012, Istanbul, Turkey. Enumeration of Salmonella enterica in naturally contaminated animal feed samples by flotation prior to real‐time quantitative PCR   Jenny Schelin1, Börje Norling2, Håkan Vigre3, Peter Rådström1 and Charlotta Löfström3  Applied Microbiology, Dep. of Chemistry, Lund University, Sweden1; QRAB, Bålsta, Sweden2;  National Food Institute, Technical University of Denmark, Søborg, Denmark3  E‐mail: jenny.schelin@tmb.lth.se and chalo@food.dtu.dk References: 1. Löfström C, et al. (2011). IJFM, 145:S103­S109. 2. Löfström C, et al (2009). BMC Microbiol, 9:85.  3. Malorny B, et al (2004). AEM 70:7046­7052. Feed sample 3. During centrifugation (~3000 x g), due to the buoyant density of  the target bacterium, it floats from the high density bottom layer through the middle layer to be accumulated at the upper interphase. 4. The target bacterium recovered from the upper interphase, separated from inhibitors and matrix particles, can now be used for further analyses. A discontinuous density gradient separation technique based on the buoyant density of bacteria1. 1. The sample is loaded at the bottom of the tube.  2.The density media (colloidal solutions of non­toxic silanised silica particles) of different densities are applied in layers according to the designed flotation set­up1. Acknowledgement: This study was financially supported by the EU project BIOTRACER (contract no. 036272) and the Swedish Research Council for Environment, Agricultural Sciences and Spatial Planning (FORMAS). Results A  method  to  quantify  Salmonella  in  feed  samples  was evaluated. This method consists of flotation1 in combination with quantification using a real­time PCR assay2, 3.   Samples  withdrawn  from  the  upper  interphase  after flotation  were  analysed  using  growth  on  selective  agar plates (XLD) to check viability and recovery. Samples were also analysed using qPCR (Figures 1 & 2).   Using artificially contaminated samples,  the qPCR method estimated  that more  cells  were  recovered  in  the  samples compared to selective plating (Figure 1). This effect is most likely due to that damaged cells were unable to grow under the applied selective pressure.   To validate the flotation protocol, Salmonella was extracted and quantified from naturally contaminated soya with qPCR (Figure  2).  Levels  were  higher  than  previously  reported, indicating  that  the  flotation  method  allows  for  isolation  of cells  not  possible  to  detect  using  standard  culture  based methods  and/or  the  presence  of  “hot  spots”  with  locally higher levels.  Flotation protocol 2.5 g feed sample is placed in a tube Method ! Addition of bottom       layer density media. ! Centrifugation. ! Addition of two layers         of density media. Real­time qPCR XLD agar plates Aim To  extract  and  quantify  Salmonella  cells  directly  from  feed  samples  by  a combination of flotation and quantitative real­time PCR (qPCR).  Introduction Animal feed might serve as a reservoir of Salmonella contributing to the spread into the food chain. Levels of Salmonella  in feed samples are  low, bacteria are unevenly distributed and stressed and could therefore be hard to recover using standard culture based methods. Due to this, there is a need for accurate, rapid and  user­friendly  sample  preparation  methods  prior  to  molecular  analyses. Moreover, to facilitate quantitative risk assessment in the feed production chain, there is a need to enumerate Salmonella in naturally contaminated feed.  y = 0.9957x + 0.2987R² = 0.93y = 0.8709x ­ 0.2515R² = 0.9612345671 2 3 4 5 6 7Recovered Salmonella (log CFU/2.5 g feed)Artificially inoculated Salmonella (log CFU/2.5 g feed)PCRXLD012341 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29RecoveredSalmonella(log CFU/g feed)Sample no.Limit of quantificationFigure 1. Quantification of cells in samples withdrawn from the upper interphase after flotation using qPCR and plating on selective plates.  Figure 2. Quantification of cells in naturally contaminated samples using flotation followed by qPCR.  Conclusion ! Quantification of Salmonella directly in artificially contaminated feed samples using flotation in combination with real­time PCR was possible with a linear range of 102 ­106 CFU/g feed.  ! Salmonella was detected in 7/30 naturally contaminated subsamples (levels up to 7.8×103 CFU/g feed). This is higher than previously reported, indicating the presence of “hot­spots” and/or non­culturable Salmonella cells. Bacteria Flotation Centrifugation Upper interphase Bottom layer Middle layer Top layer 

Enumeration of Salmonella enterica in naturally contaminated animal feed samples by flotation prior to real-time quantitative PCR

http://orbit.dtu.dk/ws/files/10444646/prod11345786482548.FINAL_120822_poster_FoodMicro2012_foder_flotation.pdf

Enumeration of Salmonella enterica in naturally contaminated animal feed samples by flotation prior to real-time quantitative PCR

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Online Research Database In Technology

Online Research Database In Technology