Desarrollo y validación experimental de un método para la obtención de estructuras de complejos ligando/receptor basado en Resonancia Magnética Nuclear

Abstract

284 p.-44 fig.-13 tab.[EN]Molecular recognition plays a key role in many cellular processes. Knowledge about the structure of the molecular complexes implicated in these cellular events is therefore important to understand cellular mechanisms. For cell function, it is important that most of the processes are reversible, and thus the molecules are often weakly associated. X-ray diffraction is a widely used technique in the structural analysis of molecular complexes; however, it has the disadvantage of not being useful in solving the structure of molecular complexes with low association constants. In these complexes, symmetry in the crystal is affected by the abundance of empty binding pockets. In the case of reversible molecular complexes formed by ligands with low molecular weight with macromolecules, the crystallographic methods are not able to extract information in order to describe the entire structure. This disadvantage can be resolved using complementary Nuclear Magnetic Resonance (NMR) techniques, and integrating the structural information obtained by both techniques. NMR is an extremely versatile technique that can be used to obtain structural information from molecules or their molecular complexes. For biological systems, NMR is a very useful technique to study the structure of proteins, lipids or polysaccharides. Two-dimensional transferred nuclear Overhauser effect spectroscopy (TR-NOESY) and Saturation Transfer Difference experiments (STD-NMR) are NMR methods widely used to study biological interactions. Both techniques allow studying molecular complexes with low association constants because they can measure magnetization from molecules in solution. TR-NOESY provides information about the conformation of low molecular weight ligands when bound to macromolecules and STD-NMR contains information about the binding epitope of a small molecule bound to a protein. In this work, we have designed a hybrid methodology, able to obtain the structures of macromolecular complexes by using STD-NMR data, TR-NOESY conformational state of the ligand and the partially solved protein-ligand structure obtained by X-ray diffraction. In order to ensure that the methodology solves the molecular complexes analytically, a new auto-consistent algorithm is implemented to solve the binding pose of protein-ligand complexes based on STD-NMR data. For ensuring that the algorithm is auto-consistent, five new descriptors have been implemented to differentially evaluate the fitting of the STD-NMR maps back calculate from a binding pose with the experimental data.The algorithm uses the structure of macromolecule partially solved by X-ray diffraction, the STD-NMR data and the TR-NOESY conformation of ligand to estimate chemical-physical parameters of the system (such as the apparent binding constant and the protein apparent correlation time) and to solve the structure of molecular complex fitting the experimental STD-NMR map and the calculated one. The structure of the molecular complex with the new structural information obtained can then be iteratively refined using steps of electron density and STD-NMR maps fitting until the solved structure is found to be consistent with both techniques. Finally, the structure of dactylolide, a microtubule-stabilizing agent, was solved bound to the luminal taxane site in T2R tetramers using the hybrid methodology. Dactylolide has a fast chemical interchange between free and bound states, which leads to a reduction of crystallographic resolution in the binding site. The analysis of dactylolide-T2R structure and the crystallographic structure of zampanolide, a structural homologous of dactylolide, allows characterizing the covalent reaction mechanism of drugs in the Taxol site.[ES]El conocimiento estructural de los complejos moleculares entre proteínas y moléculas pequeñas permite obtener información útil para el estudio de la maquinaria celular. Entre los complejos moleculares, existen muchas interacciones de baja afinidad que regulan interacciones transitorias. La resolución estructural de estos complejos proteína-ligando de baja afinidad tiene vital importancia, por su relevancia en los mecanismos de regulación celular. No obstante, la resolución estructural es ardua y en muchos casos llega a ser inviable debido a sus bajas constantes de asociación. En estas condiciones, es difícil extraer información estructural suficiente por DRX o crio-ME para poder resolver analíticamente la estructura de los complejos. Sin embargo, diversas técnicas de RMN permiten extraer parte de la información estructural de este tipo de complejos. Con objeto de resolver complejos moleculares controlados por un intercambio químico rápido, se diseñó una metodología híbrida basada en datos de RMN y DRX capaz de abarcar la resolución estructural de complejos proteína-ligando con bajas constantes de asociación. La metodología combina datos estructurales cristalográficos de la proteína, datos conformacionales del ligando obtenidos por TR-NOESY y datos del contacto entre la proteína y el ligando obtenidos mediante STD-NMR, para resolver la estructura de complejos proteína-ligando de baja afinidad. Para combinar los datos de STD-NMR con el resto de las técnicas es necesario el desarrollo de una metodología fiable que determine automáticamente la orientación del ligando en el sitio de unión. Por ello se diseñaron nuevas variantes de la función de error residual entre los datos experimentales y los modelos de estructuras generadas para evaluar la calidad de los modelos. Estas variantes del factor junto con el factor R-NOE clásico se implementaron en el programa STD-MaPa. STD-MaPa es el núcleo de la metodología hibrida de RMN-DRX y fue creado para automatizar el acoplamiento guiado por datos de STD-NMR de las moléculas de ligando en el sitio activo conocido de los complejos proteína-ligando. La metodología implementada en el programa fue probada usando como referencia cinco complejos moleculares que tienen sus estructuras resueltas por DRX y cuyos datos de STD-NMR eran conocidos. El STD-MaPa resolvió correctamente las cinco estructuras cristalográficas.Por último, se estudió la estructura de la dactilolida unida al tetrámero de tubulina. La dactilolida forma parte de una nueva familia de drogas capaces de unirse covalentemente a la -tubulina evitando así la resistencia tumoral por sobreexpresión de bombas de membrana. Esta droga se une covalentemente a la proteína pero esta unión, presenta una cinética de asociación muy lenta, lo que impide su resolución estructural por DRX. En este trabajo se consiguió resolver la estructura de la dactilolida unida no covalentemente al tetrámero de tubulina con la metodología híbrida RMN-DRX. Además, se identificaron dos orientaciones en la subunidad de tubulina menos accesible del cristal del tetrámero T2R en una proporción del 83% y 17%. Analizando la orientación predominante y la estructura cristalográfica de su homólogo estructural zampanolida se pudo describir el mecanismo de reacción covalente de esta familia de drogas para la unión a la -tubulina. Este mecanismo permitirá el diseño de nuevos fármacos que presenten la unión covalente y puedan eludir los mecanismos de resistencia a fármacos de las células cancerígenas.Fundación de Investigación de la UAB (UABRF), los Institutos Nacionales para la salud (NIH) y la National Science Foundation (NSF) de EE. UU. otorgando licencia de CORCEMA-STPeer reviewe