El lactosuero es un residuo de la industria láctea, proveniente de la elaboración de quesos, que suele ocasionar un problema ambiental importante por los grandes volúmenes con elevada carga orgánica que se generan: se estima que se requieren 10 L de leche para producir 1 a 2 kg de queso, mientras se eliminan 8-9 L de suero con valores DBO de 30-60 kg/m3 (López Ríos et al., 2006; Guimarães et al., 2010; Beltrán y Acosta, 2013). No obstante, este residuo orgánico ofrece diversas posibilidades de valorización, siendo una de ellas la producción de bioetanol (biocombustible usado en el corte de la nafta) a partir del aprovechamiento de su composición en carbohidratos.Fil: Vales, M. Eugenia. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ingeniería Olavarría; ArgentinaFil: Capdevila, Verónica E.. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ingeniería Olavarría; ArgentinaFil: Iraporda, Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil; Argentina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ingeniería Olavarría; ArgentinaFil: Rubel, Irene Albertina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil; Argentina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ingeniería Olavarría; ArgentinaFil: Gely, María Cristina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ingeniería Olavarría; ArgentinaFil: Pagano, Ana M.. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ingeniería Olavarría; Argentin

Capdevila, Verónica E.

Gely, María Cristina

Iraporda, Carolina

Pagano, Ana M.

Rubel, Irene Albertina

Vales, M. Eugenia

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INTRODUCCIÓNEl lactosuero es un residuo de la industria láctea, pro-veniente de la elaboración de quesos, que suele ocasio-nar un problema ambiental importante por los grandesvolúmenes con elevada carga orgánica que se generan:se estima que se requieren 10 L de leche para producir1 a 2 kg de queso, mientras se eliminan 8-9 L de suerocon valores DBO de 30-60 kg/m3 (López Ríos et al.,2006; Guimarães et al., 2010; Beltrán y Acosta, 2013).No obstante, este residuo orgánico ofrece diversasposibilidades de valorización, siendo una de ellas laproducción de bioetanol (biocombustible usado en elcorte de la nafta) a partir del aprovechamiento de sucomposición en carbohidratos. La producción de combustible de segundageneración (bioetanol-2G) por conversión del lactosue-ro es una alternativa de gran interés para la utilizaciónde este subproducto industrial (Dragone et al., 2009;Parra Huertas et al., 2009). El proceso fermentativoposterior a la hidrólisis origina un rendimiento de eta-nol en el rango de 75-85% del valor teórico, conside-rando que cada 0.538 kg de etanol producido se requie-re de 1 kg de lactosa metabolizada. Esto refleja laimportancia que tiene el aprovechamiento de la lactosadel lactosuero en la producción de etanol.La obtención de bioetanol-2G a partir de estetipo de residuos alimenticios involucra cuatro etapas fun-damentales: pretratamiento del residuo, hidrólisis, fer-mentación, separación y purificación del producto desea-do (Dagnino et al., 2013). La lactosa es un disacárido quese encuentra en gran proporción en el lactosuero (70%del contenido total de sólidos) (Gajendragadkar et al.,2017). A partir de la reacción de hidrólisis de la lactosa dellactosuero es posible obtener los monosacáridos α-glu-cosa y β-galactosa (Figura 1), facilitando el proceso fer-mentativo posterior para obtención de bioetanol 2G (α-glucosa y β-galactosa se equilibran con α-glucosa y β-galactosa por mutarrotación).La reacción de hidrólisis de la lactosa puede sercatalizada tanto por ácidos inorgánicos (llamada hidróli-sis ácida o química) como por catalizadores biológicos(denominada hidrólisis enzimática) (Santos et al., 1998;López Ríos et al., 2006). En la catálisis química se emple-an ácidos fuertes como el ácido clorhídrico o el ácido sul-fúrico y se trabaja en condiciones operativas de alta tem-peratura (100-150°C), alcanzándose mayor velocidad dereacción con ácido clorhídrico como catalizador (Vujicicet al., 1976). En cambio, en la reacción enzimáticacomúnmente se utiliza la enzima lactasa (β-galactosida-sa) a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente.Entre las desventajas de la reacción ácida del lactosuerose pueden mencionar la desnaturalización de las proteí-nas del suero y la formación de productos indeseados atemperaturas mayores de 100°C. Mientras tanto, para lareacción enzimática las principales desventajas son lapolimerización de la lactosa o de la galactosa para produ-cir GOS (mezcla de galacto-oligosacáridos) y las limita-ciones en la transferencia de masa que conducen a tasasde procesamiento muy lentas y elevados costos de pro-cesamiento y enzima cuando ésta no se reutiliza(Gajendragadkar et al., 2017).OBJETIVOS DEL TRABAJOEstudiar experimentalmente la reacción de hidrólisis dela lactosa (principal carbohidrato del lactosuero) por víaquímica y enzimática con el objetivo de analizar sus ven-tajas comparativas.MATERIAL Y MÉTODOSPara evaluar los procesos de hidrólisis ácida y enzimáti-ca del lactosuero se preparó un sustrato modelo -repre-sentativo su composición en carbohidratos- a partir de ladisolución de lactosa monohidratada (Merck Millipore®)en agua destilada, a una concentración de 50 g/L (•ernerTecnología Láctea Latinoamericana Nº 10738PROCESOS REVALORIZACIÓN DEL LACTOSUERO:ESTUDIO DE LA HIDRÓLISIS PARAOBTENCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLE M.E. Vales1,3; V.E. Capdevila3; C. Iraporda2,3;I. Rubel2,3; M.C. Gely3; A.M. Pagano31Becaria de Iniciación Científico-Tecnológica - Facultad de Ingeniería - Universidad Nacional delCentro de la Provincia de Buenos Aires (UNICEN).Olavarría, Buenos Aires, Argentina2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Argentina3Núcleo TECSE - Depto. de Ingeniería Química yTecnología de los Alimentos - Facultad de Ingeniería -Universidad Nacional del Centro de la Provincia deBuenos Aires (UNICEN). Olavarría, Buenos Aires,Argentina. et al., 2008; Heinzerling et al., 2012; Fisher et al., 2013).La cinética de ambos procesos se evaluó mediante unametodología alternativa no convencional de bajo costocomparativo (Heinzerling et al., 2012) que consiste enemplear un glucómetro clínico automático (Accu-Chek®meter) de lectura directa de la concentración de glucosadurante la hidrólisis, realizándose la validación de estemétodo a través de la técnica analítica de cromatografíalíquida de alta eficiencia (HPLC).El medidor digital automático de glucosa es undispositivo frecuentemente empleado en pacientes condiabetes para controlar los niveles de glucosa en sangre.El instrumento funciona a través de un sistema electro-químico que permite obtener un resultado de medicióninmediata, cuya lectura de pantalla expresa la concentra-ción de glucosa total en mg/dL (Heinzerling et al., 2012).Diseño experimentalHidrólisis química ácida de la lactosa El estudio experimental de la hidrólisis ácida de la lacto-sa se llevó a cabo bajo condiciones operativas optimiza-das según lo descrito por Gajendragadkar et al. (2017),con la finalidad de evitar los efectos indeseados delempleo de altas temperaturas. La reacción fue conduci-da en un reactor batch de 2000 mL termostatizado a latemperatura de reacción, empleando ácido clorhídrico 3N (Merck®) como catalizador en una relación 1:1 conrespecto al sustrato. El reactor fue sumergido en unbaño ultrasónico (Testlab, frecuencia 40 kHz) a fin delograr una eficiente agitación de la mezcla reaccionanteque permite trabajar a 55°C, una temperatura notable-mente inferior a las temperaturas habitualmente emple-adas en la hidrólisis ácida (Gajendragadkar et al.,2017). El seguimiento de la reacción se efectuó duran-te tres horas, extrayéndose muestras de 20 mL de lamezcla reaccionante a intervalos regularmente espacia-dos. Una vez extraída cada muestra fue inmediatamen-te inactivada por neutralización con solución de hidró-xido de potasio y en freezer (-18°C) hasta su análisis.Los ensayos se realizaron por duplicado. Hidrólisis enzimática (biológica) de la lactosa- Determinación preliminar de la concentración (dosis)de enzima necesaria. La experiencia de hidrólisis enzimá-tica se realizó utilizando una enzima comercial β-galacto-sidasa (NOLA®Fit 5500, CHR Hansen) en forma líquidaaltamente purificada obtenida de Bifidobacterium bifi-dum producida en Bacillus licheniformis, con actividadmedia de 5500 BLU/g (Bifido Lactase Units por gramo),densidad de 1.10-1.20, pH de 5.40-7.00. Esta enzima fueseleccionada por la ventaja de presentar alta actividad abajos niveles de pH, comparativamente con otras lacta-sas tradicionales que pueden encontrarse en el mercado(McCall, 2019). A fin de evaluar el efecto de la concentra-ción del biocatalizador NOLA®Fit 5500 sobre la cinéticade reacción, se realizaron ensayos de hidrólisis de lacto-sa en una concentración de 50 g lactosa/L con diferentesdosis de enzima (rango: 5-29 µL/mL de sustrato) bajo lascondiciones recomendadas como óptimas para la enzi-ma (40°C; pH 6) (CHR Hansen). A diferentes tiempos dereacción se extrajeron muestras del medio reaccionante,sobre las cuales se cuantificó el contenido de glucosautilizando el glucómetro automático y mediante HPLC, afin de determinar la máxima conversión de la lactosa englucosa con la mínima concentración de enzima (µL/mLde sustrato). En la técnica de HPLC se empleó un croma-tógrafo (ThermoScientificDionexUltimate 3000) con unacolumna Phenomenex Monosaccharide RCM y un detec-tor de Índice de Refracción. Las condiciones de corridafueron: fase móvil agua desionizada, flujo de 0.6 mL/min,temperatura 60°C, presión de 22 bar.   Tecnología Láctea Latinoamericana Nº 107 39PROCESOSFIGURA 1 - Reacción de hidrólisis de la lactosa (Fuente: NOLA®Fit 5500).- Cinética de hidrólisis enzimática. Una vez evaluada laactividad de la enzima, se definió la dosis mínima nece-saria con máxima actividad a emplear en el estudio de lacinética de la reacción de hidrólisis. Se emplearon tubosde ensayos de 10 mL conteniendo el sustrato con unaconcentración de 50 g/L de lactosa a pH regulado a 6(CHR Hansen, 2016), los cuales fueron colocados en unbaño termostatizado (40°C). A tiempo cero se les añadióla enzima β-galactosidasa NOLA®Fit 5500 a la concentra-ción determinada previamente (5 µL/mL de sustrato). Elseguimiento de la reacción se llevó a cabo durante 20minutos, extrayéndose muestras cada cinco minutos, lascuales se inactivaron por inmersión en un baño a 90°Cdurante tres minutos y luego se almacenaron en freezer(-18°C) hasta el momento de su análisis. Los ensayos sehicieron por duplicado.Determinación del grado de hidrólisis por el métodoalternativo de glucómetro clínicoEl grado de hidrólisis de la lactosa se cuantificó por elmétodo clínico de análisis de glucosa utilizando un glu-cómetro que emplea tiras reactivas de sistema enzima-coenzima GDH/PQQ (Roche Diagnostic Accu-Chekmeter). Las muestras obtenidas a cada tiempo de reac-ción fueron equilibradas a la temperatura ambiente y eva-luadas utilizando un glucómetro de lectura directa paraglucosa en sangre (rango 10 a 600 mg/dL, Accu-ChekPerforma), realizándose diluciones adecuadas para elrango operativo del instrumento. La concentración deglucosa en las muestras hidrolizadas se estimó a travésde una curva de calibración, obtenida por lectura con glu-cómetro de distintas soluciones patrón de concentraciónconocida de glucosa (Sigma Aldrich).Determinación del grado de hidrólisis por el método HPLCA fin de realizar la cuantificación del gradode hidrólisis de la lactosa mediante HPLC,se obtuvieron curvas de calibración de lospatrones puros de lactosa, glucosa y galac-tosa de grado analítico (Sigma Aldrich). Seprepararon soluciones de los patronespuros a distintas concentraciones (volumende inyección 20 µL, eluyente agua, flujo de0.6 mL/min), las cuales se inyectaron en elequipo obteniéndose cromatogramas comolos que se muestran a modo de ejemplo enlas figuras 2 y 3 para lactosa y galactosa. Enestos cromatogramas es posible diferenciarlos azúcares por su tiempo de retención, locual evidencia la selectividad que el métodopresenta para cuantificar o cualificar los analitos (Figueroaet al., 2013). Asimismo, evaluando la resolución (r) delmétodo mediante la Ec. (1) (Figueroa et al., 2013), entrelos picos de galactosa y lactosa en función de los tiemposde retención correspondientes (tgal y tlac) y del ancho delos picos en la base (wgal y wlac) de cada patrón, se obtu-vo un valor de 1.97 lo que evidencia una muy buena sepa-ración de analitos mediante esta metodología.Para el patrón glucosa, la resolución tanto con respectoa la galactosa como a la lactosa fue r=1, demostrandotambién la elevada resolución de la técnica. En la biblio-grafía se han referenciado valores de resolución porHPLC en este orden para carbohidratos (Kamal y Klein,2011; Figueroa et al., 2013). Para la evaluación, lasmuestras extraídas durante las experiencias de hidrólisiscatalítica, previo a la determinación cromatográfica, seequilibraron con la temperatura ambiente y se filtraroncon filtros de membrana de acetato celulosa (0.45 µm).RESULTADOS Comparación de metodologías analíticas decuantificación de la hidrólisis de lactosaTanto en la experiencia de hidrólisis ácida como en laenzimática, las muestras extraídas se analizaron porambas metodologías, glucómetro clínico y HPLC. Lasfiguras 4 y 5 muestran correlación entre las observacio-nes (R2>0,96) realizadas por ambas técnicas, lo cualpermite validar el  método alternativo no convencional enel rango de estudio. Otros autores (Nieto y Pirola, 2007)también han validado este método alternativo para cal-Tecnología Láctea Latinoamericana Nº 10740PROCESOSFIGURA 2 - Cromatograma del patrón lactosacular indirectamente los porcentajes de hidrólisis de lalactosa de la leche mediante el uso de un aparato medi-dor de glucosa en sangre, obteniendo resultados com-parables con los que se obtienen por el método decrioscopía. Determinación de dosis requeridade enzimaComo resultado de la evaluación del efecto de la dosis dela enzima (µL/mL) sobre el porcentaje de sustrato hidro-lizado en el tiempo bajo las condiciones óptimas (40 °C,pH 6), se obtuvieron las curvas que semuestran en la Figura 6 (valores promediode duplicados). Para ambas dosis de enzi-ma, la hidrólisis alcanzó el equilibrio luegode 20 minutos, obteniéndose conversionesestadísticamente equivalentes (p>0.05) delorden del 75%. En función de ello, desde elpunto de vista de la economía del procesose seleccionó la menor concentración deenzima ensayada, 5 µL/mL de sustratomodelo para llevar a cabo el proceso dehidrólisis de la lactosa bajo las condicionesoperativas fijadas.Cinética de los procesos de hidrólisisácida y enzimáticaComo resultado de los ensayos de hidróli-sis ácida (a) y enzimática (e) desarrolladosbajo las condiciones antes descritas, seobtuvieron las curvas experimentales que semuestran en la Figura 7, en términos de con-versión porcentual del sustrato (lactosa) enfunción del tiempo de reacción (líneas con-tinuas con símbolos). Comparativamente,se incluyen resultados informados por otrosautores para condiciones experimentales ysustratos similares. En primer lugar puedeobservarse que la curva experimental obte-nida para la hidrólisis ácida es análoga a lareportada por Gajendragadkar et al. (2016)para el proceso ultrasónico. Para la hidróli-sis enzimática en las condiciones del pre-sente trabajo se obtuvieron conversionesdel orden del 80%, al igual que han reporta-do otros autores, como Jurado et al. (2002)y Beltrán y Acosta (2012), pero a menortiempo de proceso. Ello puede atribuirse adiferentes aspectos que influyen sobre lavelocidad de reacción. Estos autores emple-aron menores dosis de la enzima β−galac-tosidasa (0.5 µL/mL y 0.1 µL/mL, respecti-vamente), lo cual podría redundar en proce-sos de hidrólisis más lentos, y por otraparte, utilizaron enzimas β−galactosidasade otros orígenes (K. lactis y K. fragilis, res-pectivamente). Tecnología Láctea Latinoamericana Nº 107 41PROCESOSFIGURA 3 - Cromatograma del patrón galactosaFIGURA 4 - Correlación lineal entre la conversión porcentualde la lactosa determinada por glucómetro y la obtenidapor HPLC durante la hidrólisis ácidaFIGURA 5 - Correlación lineal entre la conversión porcentualde la lactosa determinada por glucómetro y la obtenida porHPLC durante la hidrólisis enzimáticaFinalmente, analizando las curvas obtenidas en este tra-bajo experimental resulta evidente la importante ventajade la hidrólisis enzimática comparada con la hidrólisisquímica, en cuanto a la marcada reducción de tiempo deproceso (Figura 7).CONCLUSIONESSe estudiaron experimentalmente las reacciones dehidrólisis ácida y enzimática de la lactosa (azúcar mayo-ritario del lactosuero) bajo diferentes condiciones, comoetapa inicial para la obtención de bioetanol-2G a partir deese residuo de la industria de alimentos. Ambos proce-sos fueron evaluados mediante dos metodologías decuantificación del grado de hidrólisis del sustrato: unmétodo alternativo no convencional basado en el uso deun glucómetro clínico y la técnica analítica basada encromatografía por HPLC, encontrándose buena correla-ción (R2>0.96) entre las determinacionesde ambos métodos. La hidrólisis ácida dela lactosa (50 g/L) catalizada por HCl 3 N a55°C asistida por ultrasonido permitióobtener conversiones de lactosa del ordende 45% en tres horas. Mientras quemediante la hidrólisis biológica catalizadapor la enzima β−galactosidasa se alcanzóuna conversión de lactosa del 83% en 20minutos, empleando una dosis de enzimade 5 µL/mL de sustrato a una temperaturade 40°C en solución tamponada a pH 6.REFERENCIASBeltrán F., L.J.; Acosta C., A. (2013). Empleo de una •-galacto-sidasa comercial de Kluyveromyces lactis en la hidrólisis delactosuero, Hechos Microbiológicos 3(2), 25−35.CHR Hansen (2016). NOLA® Fit 5500. Información del pro-ducto, Versión 1 PI GLOB ES, www.chr-hansen.com.Dagnino, E.P.; Chamorro, R.E.; Romano, D.S.; Felissia, F.; Área,M.C. (2013). Optimization of the acid pretreatment of rice hullsto obtain fermentable sugars for bioethanol production,Industrial Crops and Products 42, 363−368.Dragone, G.; Mussatto, S.; Oliveira, J.;  Teixeira, J.(2009). Characterisation of volatile compounds in analcoholic beverage produced by whey fermentation,Food Chemistry 112(4), 929–935.Figueroa, L.B.; Hernaez, L.; Bello, M. (2013). Validaciónde un método de determinación de fructosa, glucosa ysacarosa por Cromatografía Líquida de AltaPerformance, SNS 1(2), 27−35.Fisher, J.; Zanella Guidini, C., Soares Santana, L.N.; deResende, M.M.; Luiz Cardoso, V.; Ribeiro, E.J. (2013).Optimization and modeling of lactose hydrolysis in apacked bed system using immobilized •-galactosidasefrom Aspergillusoryzae, Journal of Molecular CatalysisB: Enzymatic 85–86, 178–186.Gajendragadkar, C.N.; Gogate, P.R. (2017). 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NOLA® FIT: para asegurar el auténtico sabor de losproductos deslactosados y/o con bajo contenido de azúcar, LaAlimentación Latinoamericana, XXIII(106), 6-10.Nieto, I.; Pirola, M.B. (2007). Método alternativo para medida de hidrólisisde lactosa, 6° Jornada de Desarrollo e Innovación Tecnológica, INTI(Instituto Nacional de Tecnología Industrial), 1−2, Rafaela, Argentina.Santos, A.; Ladero, M.; García-Ochoa, F. (1998). Kinetic modeling of lacto-se hydrolysis by a •-galactosidase from Kluyveromicesfragilis, Enzyme andMicrobioal Technology 22, 558−567.•erner, N.; K•l•çApar, D.; Demirhan, E.; Ozbek, B. (2008). Milk lactosehydrolysis in a batch reactor: Optimisation of process parameters, kineticsof hydrolysis and enzyme inactivation, Chem. Biochem. Eng. Q. 22(2),185–193.Vujicic, I.F.; Lin, A.Y.; Nickerson, T.A. (1976).Changes during acid hydroly-sis of lactose, J. Dairy Sci. 60(1), 29–33.Tecnología Láctea Latinoamericana Nº 10742PROCESOS FIGURA 6 - Efecto de la dosis de enzima β−galactosidasa utilizadaen la hidrólisis sobre el porcentaje de sustrato hidrolizadopor unidad de tiempoFIGURA 7 - Conversión porcentual de lactosa en funcióndel tiempo de hidrólisis ácida y enzimática

Revalorización del lactosuero: estudio de la hidrólisis para obtención de biocombustible

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