INTRODUZIONE: CBFA2T3-GLIS2 è un gene di
fusione presente nel 15-25% delle AMKL. L’obiettivo di
questo studio è stato quello di ingegnerizzare delle iPSC
con CBFA2T3-GLIS2.
METODI E RISULTATI: Per ingegnerizzare le iPSC da
donatore abbiamo sfruttato il locus AAVS. Il locus AAV,
usato generalmente per l’integrazione dall’adenovirus
codifica per il gene PPP1R12C e la sua distruzione non
associa con alcuna patologia conosciuta.Il gene di fusione
è stato clonato nel vettore AAVS1 SA-2A-puro-pA
donor. Per riprodurre un modello altamente fedele siamo
andati a verificare l’espressione di CBFA2T3 nelle iPSC.
I risultati hanno dimostrato che il gene non era espresso
nelle iPSC (Figura 1A), quindi abbiamo inserito il gene
di fusione marcato con GFP sotto il controllo di un promotore
ematopoietico, il CD43. Le iPSC sono state quindi
ingegnerizzate con questo vettore attraverso ricombinazione
omologa “ZingFinger” mediata (Figura 1B). Dopo elettroporazione le iPSC sono state selezionate con
Puromicina. Su 24 colonie resistenti all’antibiotico, 23
avevano integrato CBFA2T3-GLIS2 in omozigosi e 1 in
eterozigosi. 3 di queste colonie sono state amplificate e
validate per le caratteristiche di pluripotenza e per l’espressione
di CBFA2T3-GLIS2 nelle cellule ematopoietiche
differenziate. I risultati hanno dimostrato che le
iPSC ingegnerizzate avevano mantenuto le caratteristiche
di pluripotenza (Figura 1C) e il gene di fusione insieme
a altri geni direttamente regolati da CBFA2T3-GLIS2
come ERG erano correttamente espressi nelle cellule
ematopoietiche derivate dalla differenzazione delle iPSC
(Figura 1C).
CONCLUSIONI: Le iPSC ingegnerizzate nel locus
AAVS1 sono un modello altamente fedele e efficiente
per studiare l’effetto di fusioni di interessa onco-ematologico
