Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Consuelo Andrade MarquesCoorientadora: Dr.ª Sonia Mesia VelaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em FarmacologiaInclui referências: p. 97-109Resumo: A Achillea millefolium L. conhecida popularmente como mil folhas e pronto alívio é amplamente utilizada pela população mundial para uma variedade de doenças incluindo o tratamento de distúrbios gastrointestinais e dor. Estudos científicos já validaram alguns desses usos populares da espécie embora os efeitos da planta no trato gastrointestinal (TGI) permaneçam sem avaliação. Este trabalho teve por objetivo validar as ações do extrato bruto aquoso das folhas da A. millefolium, obtida de cultivo controlado e padronizado, no TGI como gastroprotetor. Também visamos determinar o(s) mecanismo(s) desta atividade assim como identificar a(s) provável(is) substâncias(s) ativa(s) responsável(is) por esta(s) ação(ões). Para a determinação da atividade gastroprotetora da A. millefolium, estudamos os efeitos do extrato bruto aquoso (EABA, 125-2000 mg/kg - vo) na lesão gástrica experimental assim como na secreção acida gástrica e na motilidade intestinal. Para isto, o extrato bruto aquoso das folhas de A. millefolium (EABA) foi preparado de acordo com a sua utilização popular (extração 10%, a 70 °C durante 30 minutos, três extrações sucessivas, rendimento 29%). A ação do EABA na úlcera gástrica experimental foi avaliada nos modelos de lesão aguda induzida por estresse (imobilização a 4 °C/3 h), por um antiinflamatório não-esteroidal (indometacina, 20 mg/kg - sc) e por um agente necrotizante etanol (70%, 0,5 ml/200 g - vo). O extrato da A. millefolium protegeu os animais contra lesões gástricas induzas pela indometacina e pelo etanol mas não aquelas induzidas por estresse. Como a proteção da mucosa gástrica pelo EABA foi mais potente contra lesões induzidas pelo etanol (DI50 = 936 mg/kg - vo) que pela indometacina (DI50 > 2000 mg/kg - vo), o modelo de etanol foi utilizado para o estudo dos mecanismos gastroprotetores do extrato. A ação do EABA sobre dois importantes fatores protetores da mucosa gástrica, como a concentração de muco gástrico e a concentração de grupamentos sulfidrílicos não-protéicos (GSH) assim como na atividade das enzimas antioxidantes gástricas (NADPH quinona oxidoredutase 1 - NQ01, glutationa S-transferase - GST e catalase - CAT), foram avaliadas neste modelo. O EABA diminuiu a depleção de GSH induzida pelo etanol sem estimular as atividades das enzimas antioxidantes, indicando que o efeito gastroprotetor da planta estaria relacionada com a ativação de fatores citoprotetores dependentes de GSH. No entanto, neste experimento de lesão aguda verificou-se que o EABA reduz a atividade da GST em 32%. Resultados similares foram obtidos após tratamento subcrônico (EABA, 1000 mg/kg - vo/7 dias) indicando que o extrato não possui uma ação antioxidante que contribua para o efeito gastroprotetor. O estudo dos efeitos do EABA na secreção ácida gástrica foi avaliada utilizando o modelo da ligadura pilórica (4 h em ratas), na presença de agonistas de receptores muscarínicos Mi e M3 (betanecol), receptores de gastrina CCKB (pentagastrina) e receptores histaminérgicos H2 (histamina). O EABA reduziu a secreção acida basal e a estimulada por histamina e betanecol sem alterar a secreção induzida por pentagastrina indicando uma possível atividade sobre a bomba de prótons. Complementamos então o estudo com a determinação das atividades do EABA sobre a atividade da enzima H+/K+-ATPase isolada de mucosa gástrica de cachorro, que foi inibida pelo EABA com CI50 = 382 [Mi]g/ml. Esses resultados mostram que há também participação de um efeito antisecretor por bloqueio da bomba de prótons no mecanismo de gastroproteção do extrato. Os efeitos do EABA na motilidade do trato gastrointestinal foi avaliado pelos métodos de esvaziamento gástrico, trânsito intestinal e diarréia induzida por óleo de rícino. O EABA não alterou nenhum desses parâmetros, permitindo-nos descartar efeitos colinérgicos e adrenérgicos na atividade gastroprotetora do extrato. Da grande variedade de compostos isolados da A. millefolium, obtivemos os flavonóides rutina e quercetina e o óleo volátil do Laboratório de Fitoquímica da UFPR, que trabalha com a mesma amostra da planta, e avaliamos seus efeitos no modelo de lesão por etanol e no modelo de hipersecreção por ligadura pilórica. A quercetina (50-200 mg/kg - vo) protegeu os animais contra as lesões gástricas induzidas pelo etanol (DI50 = 93 mg/kg - vo) mas não reduziu a secreção ácida gástrica nos animais com ligadura pilórica. No entanto, a rutina, nas doses testadas (50-200 mg/kg - vo) e o óleo volátil (5-50 mg/kg - vo) não alteraram a secreção ácida de animais com ligadura pilórica nem protegeram os animais de lesões gástricas induzidas por etanol. Ambos os flavonóides reduziram a atividade de hidrólise de ATP pela H+/K+-ATPase isolada de cachorro com CI50 = 231 e 339 [Mi]M, respectivamente. Em conjunto, nossos resultados permitem sugerir que o EABA possui efeito gastroprotetor contra lesões induzidas pelo etanol. O mecanismo da ação gastroprotetora parece ocorrer por mecanismos dependentes da ativação de fatores de proteção relacionados ao GSH e com participação do efeito inibitório da secreção acida gástrica. É evidente também que os flavonóides, rutina e quercetina, seriam dois possíveis mas não as únicas substâncias ativas da planta.Abstract: Achillea millefolium L. popularly known as "mil folhas" and "pronto alivio" is widely used for a variety of illnesses including gastrointestinal disturbances and pain. Scientific studies confirmed some of Achillea's folk uses although its effects on the gastrointestinal tract (GIT) remain without evaluation. The aim of the present study was to validate of the effects of aqueous crude extract (EABA) of A. millefolium leaves on the GIT as gastroprotective. The plant was obtained from a controlled and standardized germoplasm bank. We also try to identify the mechanism(s) as well as the active principles responsible for the gastroprotective action of the plant. For the determination of the gastroprotective activity of A. millefolium, we studied the effects of the EABA (125-1500 mg/kg - po) on experimental gastric lesion, gastric acid secretion and intestinal motility. For this, the EABA was prepared according to its popular use (10% extraction, 70 °C during 30 minutes, three extractions, yield of 29%). EABA action on experimental gastric ulcer was evaluated in models of acute lesion induced by stress (restraint and cold/3 h), nonsteroidal antiinflammatory (indomethacin, 20 mg/kg - sc) and necrotizing agent ethanol (70%, 0.5 ml/200 g). The extract of A. millefolium protected the animals against gastric lesions induced by indomethacin and ethanol but not against those induced by stress. Protection of gastric mucosa by EABA was more potent in the model induced by ethanol (ID50 = 936 mg/kg - po) that in the indomethacin (ID50 > 2000 mg/kg - po). Then, the model of ethanol was used for the study of gastroprotective mechanisms of the extract. EABA action on two important protective factors of gastric mucosa like the gastric mucus and non-proteic sulphydril groups (GSH) levels as well as the activity of gastric antioxidant enzymes (NADPH quinone oxidoreductase 1 - NQ01, glutathione S-transferase - GST and catalase - CAT) were also evaluated in this model. EABA reduced the GSH depletion induced by ethanol but did not alter the activity of antioxidants enzymes indicating that the gastroprotective effect of plant is related to the activation of cytoprotective factors depending of GSH and not to and antioxidant effect coming from tested enzymatic systems. However, in this experiment of acute lesion was verified that the EABA reduced the GST activity by 32%. Similar results were obtained after subchronic treatment (EABA, 1000 mg/kg - po/7 days). Although inexplicable with the present results, this effect deserves to be better studied in order to determine its full significance. The study of EABA effects on gastric acid secretion was evaluated using the pylorus ligature model (4 h in rats) with or without the presence of agonists of receptors mucarinics (bethanecol), CCKB (pentagastrin) and histaminergic (histamine). The EABA reduced both the basal and stimulated acid secretion by histamine and bethanecol without altering the one induced by pentagastrin, indicating a possible activity in a muscarinic and histaminergic receptors or in the proton pump, the final step of gastric acid secretion, common to both pathways. Thus, the study on gastric acid secretion was complemented with study of the activity of EABA on the hydrolysis of ATP by the H+/K+-ATPase isolated from dog gastric mucosa. The activity of the enzyme was inhibited by EABA with IC50 = 304 [Mi]g/ml. These results show that exist also participation of an anti-secretor mechanism which seems to be, at least in part, by blockade of the proton pump in the gastroprotective effect of the plant. EABA effects on GIT motility were evaluated through determination of its effects on gastric emptying, intestinal transit and diarrhea induced by castor oil. EABA did not alter any of these parameters allowing us to discard cholinergic effects on gastroprotective activity of the extract. From the large variety of isolated compounds of A. millefolium, we obtained the flavonoids rutin and quercetin and the volatile oil from Phytochemistry Laboratory of UFPR which works with the same lot of plant. We evaluated its effects on the ethanol induced gastric lesion and on hypersecretion model by pylorus ligature. Quercetin (50-200 mg/kg - po) protected the animals against gastric lesions induced by ethanol (ID50 = 93 mg/kg - po) but did not alter the gastric acid secretion of animals with pylorus ligature. In the other hand, rutin (50- 200 mg/kg - po) and the volatile oil (5-50 mg/kg - po) did not alter the acid secretion of animals with pylorus ligature neither protect the animals from gastric lesions induced by ethanol. However, both flavonoids reduced the hydrolysis of ATP by H+/K+-ATPase isolated of dog with IC50 = 231 and 307 [MI]M, respectively. Collectively, our results validate the popular use of A. millefolium as gastroprotective agent. The mechanism of gastroprotective action seems to occur by mechanisms depending of activation of cytoprotective factors related to GSH with participation of inhibitory effect of gastric acid secretion. It is also evident, that the flavonoids rutin and quercetin are two possible but not the only ones active principles of the plant
