Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2022STAT3 is a pleiotropic transcription factor that plays key roles in development, immunity, response
to stress/damage and cancer. Its activity is largely regulated by specific post-translational
modifications (PTMs) and protein-protein interactions. Most studies focus only on the phosphorylation
at Y705 and/or S727, neglecting almost 80 identified PTMs. Furthermore, it is unlikely that all STAT3
molecules are modified simultaneously exactly in the same residues, existing different pools of
STAT3 molecules. The main goal of this work was to determine the influence of key post-translational
modifications on STAT3 translocation to the nucleus upon canonical stimulation with cytokines from
the IL-6 family. To address this question, we first characterized a STAT3 knockout HeLa cell strain
recently developed in our laboratory and created a series of molecular tools to analyze the dynamics of
STAT3 homodimers in living cells based on BiFC (i.e., STAT3 expression plasmids with mutations
preventing key PTMs, such as Y705F, K49R, K685R, S727A, T236A, Y640F and T714A). STAT3
knockout cells have a distinct gene expression profile and increased oxidative stress. Second, we
studied the influence of symmetrically and asymmetrically modified STAT3 homodimers in their
response to cytokines. Phosphorylation of only one of the STAT3 monomers is enough to drive
STAT3 dimers into the nucleus after LIF stimulation. STAT3 dimers can accumulate in the nucleus
independently of their phosphorylation status at Y705 and LIF stimulation. And third, we studied the
effect of the disease-associated phosphoresistant Y640F mutation in the behavior of STAT3 dimers.
This mutation increases the accumulation of STAT3 in the nucleus in response to LIF but is not
related to oxidative stress and gene expression. Our results advance our understanding of STAT3
signaling and could potentially contribute to the study of several human pathologies involving STAT3,
such as cancer, hyper-IgE Syndrome, or Inflammatory Hepatocellular Adenoma.O Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 3 (STAT3) é um fator de transcrição pleiotrópico
que desempenha funções importantes numa variedade de processos fisiológicos, incluindo proliferação
celular, sobrevivência, diferenciação, inflamação, angiogénese, apoptose, progressão do ciclo celular e
migração celular. O STAT3 está constitutivamente ativo em cerca de 70% dos cancros nos humanos.
Esta ativação constitutiva deve-se maioritariamente à desregulação das vias de sinalização a montante.
Os cancros incluem tanto tumores hematológicos (ex. leucemia, linfoma ou mieloma múltiplo) como
tumores sólidos. Para além disto, mutações ativadoras no STAT3 (ex. Y640F) têm sido associadas a
algumas doenças como Leucemia Linfocítica Granular e Adenoma Hepatocelular Inflamatório.
Enquanto mutações inativadoras do STAT3 (ex. S636Y, T708S ou T714A) associam-se com a
Síndrome de hiper-imunoglobulina E. Apesar do papel claro do STAT3 no cancro, também existem
evidências de funções supressoras de tumores para o STAT3. Deste modo as consequências biológicas
da ativação do STAT3 no cancro dependem do tipo de tumor e do contexto celular.
O STAT3 é ativado a jusante de muitos tipos de sinais extracelulares, incluindo a família IL-6 de
citocinas (ex. IL-6, IL-11, fator inibidor de leucemia (LIF), etc.), hormonas (hormona do crescimento,
prolactina e leptina), fatores de crescimento (EGF, PDGF, FGF e IGF), interferões, entre outros. A
família IL-6 de citocinas ativa o STAT3 através da via de sinalização canónica JAK-STAT3. Esta via
começa com a ligação de uma citocina ao seu recetor na membrana celular. Isto ativa um dos membros
da família de Janus kinase (JAK) que por sua vez fosforila o recetor da citocina. Os dímeros de
STAT3 são recrutados ao recetor ativado e são fosforilados na tirosina 705 (Y705). Isto leva à
acumulação dos dímeros de STAT3 fosforilados no núcleo. Os mecanismos moleculares pelos quais a
acumulação no núcleo ocorre ainda estão sob discussão. Alguns investigadores defendem que o
STAT3 é maioritariamente encontrado no citoplasma de células não estimuladas e que só vai para o
núcleo após estimulação com uma citocina. Outros defendem que o STAT3 está permanentemente a
mover-se entre o citoplasma e o núcleo e que fica retido no núcleo após a sua fosforilação induzida por
uma citocina. Uma vez no núcleo, o STAT3 fosforilado liga-se ao DNA e consegue ativar ou reprimir
a expressão génica. Alguns dos genes ativados pelo STAT3 são genes pró-sobrevivência (ex. BCL2,
BCL2L1, MCL1 e BIRC5); genes de progressão do ciclo celular (ex., CCND1 e c-MYC); e genes pró migratórios (ex., MMP2). O STAT3 fosforilado também reprime a expressão de alguns genes
relacionados com a proliferação e sobrevivência celular, como TP53, FAS e NDN. A expressão e
ativação do STAT3 é altamente regulada através de uma variedade de proteínas endógenas (ex. SOCS
e PIAS) que conseguem silenciar a via de sinalização JAK-STAT3.
Para além desta via canónica, também foram descritas outras vias não canónicas do STAT3 que são
independentes da fosforilação do STAT3 no resíduo Y705. Estas vias não canónicas incluem a
atividade transcripcional do STAT3 não fosforilado e a atividade do STAT3 na mitocôndria e no
retículo endoplasmático. Nestes organelos, o STAT3 desempenha diversas funções como a regulação
da respiração e do metabolismo mitocondrial e a regulação de espécies reativas de oxigénio (ROS) e
de cálcio (Ca2+).
Ambas as vias de STAT3 canónicas e não canónicas dependem fortemente de interações com
outras proteínas e de modificações pós-traducionais (PTMs). A maioria das funções e interações do
STAT3 foram estudadas em relação à fosforilação nos resíduos Y705 ou S727. No entanto, o STAT3
tem cerca de 80 PTMs comprovadas experimentalmente, incluindo muitos outros eventos de
fosforilação, acetilação, metilação, ubiquitinação e SUMOilação. As funções biológicas destas PTMs
são pouco estudadas, e a sua influência nas interações com outras proteínas é mal compreendida. É
também improvável que todas as moléculas de STAT3 sejam modificadas simultaneamente nos
mesmos resíduos, existindo diferentes conjuntos de moléculas de STAT3 na célula. Recentemente, descrevemos que dímeros de STAT3 modificados assimetricamente apresentaram alterações no seu
comportamento e função. No entanto, estas observações foram realizadas em células que expressavam
STAT3 endógeno e em ausência de estímulo de citocinas.
O principal objetivo deste trabalho foi determinar a influência de modificações pós-traducionais
importantes na translocação do STAT3 para o núcleo, após estimulação com citocinas da família IL-6.
Para responder a esta questão, usámos células HeLa com knockout do gene STAT3 (STAT3-/-) que
foram recentemente desenvolvidas no laboratório do Dr. Federico Herrera. Primeiramente,
caracterizámos esta linha celular em termos de proliferação, stress oxidativo, níveis de Ca2+, potencial
de membrana mitocondrial, expressão génica e níveis de proteínas, usando citometria de fluxo, qPCR
e Western Blot. Observámos que as células HeLa STAT3-/- têm um perfil genético distinto e maior
stress oxidativo. Criámos também uma série de ferramentas moleculares baseadas no ensaio de
complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) para analisar a dinâmica dos homodímeros de
STAT3 nas células. Nestes ensaios BiFC, duas proteínas de interesse são unidas a duas metades
complementares não fluorescentes de um repórter fluorescente, como Vénus. Se as proteínas de
interesse interagirem, as metades do repórter unem-se reconstituindo o fluoróforo funcional. A
fluorescência é, portanto, proporcional à dimerização das proteínas e pode ser facilmente medida por
citometria de fluxo ou microscopia. Plasmídeos Venus-STAT3 BiFC, desenvolvidos previamente no
laboratório do Dr. Federico Herrera, foram modificados por site-directed mutagenesis. Resíduos
fosforiláveis (serina (S), treonina (T) e tirosina (Y)) e resíduos lisina (K) (acetiláveis, metiláveis,
ubiquitináveis e SUMOiláveis) foram mutados para resíduos estruturalmente semelhantes, não
modificáveis [fenilalanina (F), alanina (A) ou arginina (R), a depender do tipo de resíduo]. Deste
modo, foram desenvolvidos plasmídeos que expressam STAT3 com mutações que previnem PTMs
essenciais ou relacionadas com doenças humanas, como Y705F, K49R, K685R, S727A, T236A,
Y640F e T714A. Em segundo lugar, estudámos a influência dos homodímeros de STAT3 modificados
simetricamente e assimetricamente na sua resposta a citocinas. As células HeLa STAT3-/- foram
transfetadas com combinações de dois plasmídeos Venus-STAT3 BiFC complementares. Foram feitas
combinações simétricas de plasmídeos, ou seja, nas quais os dois plasmídeos eram wild type ou tinham
a mesma mutação. Também foram feitas combinações assimétricas em que os plasmídeos eram
diferentes, ou seja, um dos plasmídeos podia ser wild type e o outro podia ter uma mutação ou então
podiam ser dois plasmídeos mutados, mas com diferentes mutações. Após transfeção e tratamento com
LIF, as proteínas nucleares foram extraídas e analisadas por Western Blot. Observámos que enquanto
os dímeros simétricos de wild type STAT3 acumularam-se rapidamente no núcleo em resposta ao LIF,
os dímeros simétricos mutantes Y705F não. Os dímeros STAT3 assimétricos onde um dos monómeros
era wild type STAT3 responderam como os dímeros simétricos de wild type STAT3. Deste modo, a
fosforilação de apenas um dos monómeros de STAT3 é suficiente para provocar a translocação dos
dímeros de STAT3 para o núcleo após estimulação com LIF. Os dímeros de STAT3 podem acumular se no núcleo independentemente do seu estado de fosforilação no resíduo Y705 e de estimulação com
LIF. Em terceiro lugar, estudámos o efeito da mutação fosforesistente Y640F relacionada com
doenças no comportamento dos dímeros de STAT3. Esta mutação aumenta a acumulação de STAT3
no núcleo em resposta ao LIF, mas não está relacionada com stress oxidativo e expressão génica. Os
nossos resultados permitem aprimorar o nosso conhecimento sobre as vias de sinalização do STAT3 e
podem potencialmente contribuir para o estudo de diversas patologias humanas que envolvem o
STAT3, como cancro, Síndrome de hiper-imunoglobulina E ou Adenoma Hepatocelular Inflamatório
