Arabidopsis thaliana, lituruoho, toimii kasvikunnan malliorganismina muun muassa forosynteesireaktioiden tutkimisessa. Fotosynteesireaktioissa vihreät kasvit tuottavat kloroplasteissaan vedestä ja hiilidioksidista auringon energian avulla happea ja sokeria. FNR (Ferredoksiini-NADP+-oksidoreduktaasi-entsyymi) osallistuu fotosynteesissä elektronin-siirtoreaktioihin pelkistämällä NADP+:n NADPH-molekyyliksi, jota käytetään ATP:n kanssa hiilensidontareaktioissa.
Lituruohon genomissa kaksi eri geeniä At5g66190 (FNR1) ja At1g20020 (FNR2) koodaavat kloroplastiin ohjautuvia FNR-isoentsyymejä. Molempia isoentsyymejä esiintyy villityypin kasveilla kloroplastissa sekä liukoisessa muodossa että kiinnittyneinä tylakoidikalvoon. fnr1-poistogeenisellä kasveilla FNR1-geeni on keskeytetty, jonka seurauksena FNR1-proteiinia ei tuoteta mutta FNR2-proteiinia esiintyy kloroplastin stroomassa. fnr2-poistogeeniset kasvit eivät tuota FNR2-proteiinia mutta FNR1-proteiinia esiintyy kloroplastin stroomassa ja tylakoidikalvoilla.
Opinnäytetyön tarkoituksena on valmistaa FNR1 yliekspressiolinja fnr2-poistogeeniseen taustaan ja FNR2 yliekspressiolinja fnr1-poistogeeniseen taustaan. Yliekspressiolinjoissa tuotetaan ylimäärin kyseistä FNR-isoentsyymiä. Yliekspressiolinjoja tutkimalla pyritään selvittämään johtuuko mutanttikasvien fenotyyppi FNR:n alhaisesta totaalimäärästä vai ainoastaan toisen isoentsyymin puuttumisesta. Samalla kerätään lisätietoa fotosynteesi-mekanismeista.
Yliekspressiolinjoja tuotetaan käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikan menetelmiä. E. colin DH10B-linjan DKLAT5g66190- ja DKLAT1g20020-plasmideissa olevat FNR-geenit eristetään ja liitetään agrobakteerissa toimivaan pGWR8-plasmidiin. pGWR8-konstruktit transformoidaan agrobakteeriin, joka luonnostaan pystyy infektoimaan kasveja Ti-plasmidinsa avulla. Infektoituneet kasvit voidaan erottaa muista kasveista pGWR8-plasmidissa olevan antibioottiresistenssikasetin avulla kasvattamalla kasvin siemeniä selektiivisellä kasvatusalustalla. Vain mutatoituneet siemenet voivat kasvattaa alustalla juuria ja ne voidaan siten siirtää mullalle kasvamaan. Agrobakteerivälitteisen trasformaation tuloksena saadaan kaksi mutanttikasvia, yksi tuottaa ylimäärin FNR1- isoentsyymiä ja toinen FNR2-isoentsyymiä. Homotsygoottisia kasveja tutkitaan myöhemmin muun muassa proteiinitasolla immunoblottauksella.Arabidopsis thaliana, thale cress, is a model organism for the research of photosynthetic reactions. In photosynthesis plants use water and carbon dioxide to produce oxygen and sugar by using sunlight as the energy source. FNR (ferredoxin-NADP+-oxidoreductase enzyme) is involved in electron transfer reactions by reducing NADP+ into an NADPH molecule which is then used together with ATP in carbon fixation reactions.
The chloroplast-targeted FNR isoforms are encoded by two genes, AT5g66190 (FNR1) and At1g20020 (FNR2). In wild type plants both isoforms are present in chloroplast stroma and thylakoid membrane. fnr1 mutant line plants lack the production of FNR1 protein whereas FNR2-protein is present in the chloroplast stroma. Correspondingly, fnr2 mutant line plants lack FNR2 protein production, but FNR1 protein is present in the stroma and at the thylakoid membrane.
The objective of this thesis was to produce an FNR1 overexpression line in an fnr2 knock out plant and an FNR2 overexpression line in an fnr1 knock out plant. In each overexpression line the target FNR isoform was overproduced. The aim of studying the overexpression lines was to determine whether the phenotype of the mutant plants was due to the lower amount of one specific FNR isoform or the total amount of FNR. Also more information on plants photosynthesis was gained.
The overexpression lines were produced by recombinant DNA techniques. The FNR genes in DKLAT5g66190 and DKLAT1g20020 plasmids in E.coli strain DH10B were isolated and ligated into pGWR8 (plasmid). Only pGWR8 plasmid is capable of reproducing in both E. coli and agrobacterium cells. pGWR8 constructs are transformed into agrobacterium, which has an ability to infect plants with its T-DNA located in the Ti-plasmid. Transformed plants express a kanamycin-resistant cassette which originates from the plasmid pGWR8, and therefore, the plants can grow in a kanamycin-containing medium. The properties of the homozygote FNR1 and FNR2 overexpressor plants will be characterized later by using various techniques, i.e. photosynthetic measurements, proteomics, transcriptomics, and measurements of enzyme activities
