학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 공과대학 기계항공공학부(멀티스케일 기계설계전공), 2021.8. 전누리.In this thesis, we aim to develop “brain-in-a-well” as high-throughput platform and physiologically relevant model. Considering fabrication and liquid patterning, we developed reliable and reproducible microfluidic platform for not only the basic and applied neuroscience research but also efficient drug development. Specifically, we developed demyelination platform, high-throughput brain-on-a-chip platform, and versatile organ-on-a-chip platform.
First, we report a three-dimensional (3D) peripheral nervous system (PNS) disease-on-a-chip as an in-vitro demyelination and remyelination platform. We optimized capillary bursting valve structure for robust liquid patterning by finite element method. This polydimethylsiloxane (PDMS)-based platform enables stable microenvironment for coculture of motor neurons and Schwann cells over 40 days. In addition, the on-demand detachable substrate allows in-depth biological analysis. We demonstrated recapitulation of a full-spectrum of myelination, demyelination, and remyelination in a single platform. Furthermore, we observed the characteristic features of demyelination by ‘onion-bulb’ like formation or thin myelin structure.
Next, we report an injection molded plastic array 3D neuron culture platform (Neuro-IMPACT) as a high-throughput brain-on-a-chip platform. Based on the experience on PNS disease-on-a-chip, we devised more advanced platform in terms of scale-up fabrication and high-throughput drug screening. This polystyrene (PS)-based platform follows standardized 96 well format with a channel, which is fabricated by injection molding process. The microchannel in the Neuro-IMPACT is patterned by spontaneous capillary flow on hydrophilic state. We recapitulated various in-vitro brain microenvironment such as a 3D neural circuit, blood-brain barrier, and myelination.
Finally, we report an injection molded plastic array 3D universal culture platform (U-IMPACT) as a versatile organ-on-a-chip platform. We advanced Neuro-IMPACT in terms manufacturability and usability. The U-IMPACT has three channels and a spheroid zone with 96 well format for coculture of various cells, spheroid, and tissues. We developed hybrid liquid patterning with contact angle of materials itself and height differences of microfluidic channels, which integrates the principle of spontaneous capillary flow and capillary bursting valve. We proved that materials of platform need to be hydrophilic (contact angle of body; 45˚ ~ 90˚, substrate; < 30˚) for robust patterning. We reconstructed 3D tumor microenvironment such as angiogenesis, perfusable vascular network, and vascularized tumor spheroid. Additionally, we cultured primary neuron and neurosphere from induced neural stem cells.본 논문에서는 체내 신경계와의 유사성을 높이고 고효율 약물 스크리닝이 가능한 뇌 모사 칩인 브레인-인-어-웰 (brain-in-a-well) 제작을 목표로 하였다. 이를 위해, 공정, 패터닝, 분석의 효율성을 고려하여 높은 신뢰성 및 재현성을 가진 미세유체 플랫폼을 개발하였다. 구체적으로, 탈수초화 플랫폼, 고효율 뇌 모사 칩 플랫폼, 다용도 뇌 모사 칩 모델을 개발하였다.
먼저, 탈수초화 및 재수초화 체외 모델로서 말초신경계 질병 모사 칩 (PNS disease-on-a-chip) 을 개발하였다. 안정적인 패터닝을 위해서, 시뮬레이션을 통해 모세관 밸브 구조물을 설계 및 최적화하였다. 제작된 PDMS 플랫폼 내에서 40일 이상 운동 신경 세포와 슈반 세포의 안정적인 공배양 환경을 구축하였다. 나아가, 쉽게 탈부착 가능한 바닥면을 이용하여 효율적인 바이오 분석이 가능한 플랫폼을 제작하였다. 플랫폼 내에서 여러 약물을 통해 수초화, 탈수초화, 재수초화의 모든 과정을 모사하였으며, 각 세부 과정을 세포, 단백질, 기능 단위에서 검증하였다. 뿐만 아니라, 탈수초화 질병의 특징인 양파 모양 및 얇은 수초화를 확인하였다.
다음으로는 뉴로 임팩트 (Neuro-IMPACT) 라는 표준화된 3차원 신경 세포 배양 플랫폼을 개발하였다. 앞서 개발한 질병 모사 칩에서의 경험을 통해, 고효율 약물 스크리닝을 위해서 표준화된 플랫폼 및 대량 생산 공정의 필요성을 알 수 있었다. 사출 공정을 도입하여 96 웰 플레이트 기반의 플라스틱 플랫폼을 개발하였다. 플라즈마 및 자발적 유체 흐름을 이용하여 플랫폼 내 미세유체 채널을 패터닝하였다. 플랫폼 내 하나의 채널을 이용하여, 뇌의 미세환경인 신경 회로, 혈액-뇌 장벽, 수초화 현상을 모사하였으며, 각각의 형태학적, 기능학적 특징들을 확인하였다.
마지막으로 유 임팩트 (U-IMPACT) 라는 신경계 이외에도 다양한 미세환경을 모사할 수 있는 다재 다능한 장기모사칩을 개발하였다. 앞서 개발한 뉴로 임팩트에서의 경험을 통해, 사용성 및 제조가능성을 고려한 새로운 플랫폼의 필요성을 알 수 있었다. 유 임팩트는 세 개의 채널과 한 개의 스페로이드 구역으로 이루어져, 다양한 세포, 스페로이드, 조직을 공배양할 수 있도록 설계하였다. 나아가 모세관 밸브와 자발적 유체 흐름, 2가지 원리를 이용하여, 재료의 접촉각 및 채널의 높이차를 이용한 새로운 하이브리드 패터닝 방식을 개발하였다. 이런 패터닝 방식에 대해 이론적 모델 및 실험을 통하여, 플랫폼이 친수성일 때 안정적인 패터닝이 되는 것을 확인하였다 (본체 접촉각; 45˚~90˚, 바닥면; < 30˚). 제작된 플랫폼 내 혈관 신생, 관류화된 혈관, 혈관화된 종양 등 다양한 종양 미세환경을 모사하였다. 또한, 유도 신경 줄기 세포를 통한 뉴로스피어 (Neurosphere) 및 동물 신경 세포를 통해 신경 세포 배양 가능성을 확인하였다.Chapter 1. Introduction 1
1.1. Background of brain-on-a-chip 1
1.2. Purpose of Research 4
Chapter 2. A Peripheral Nervous System-on-a-Chip for Disease and Regeneration Model 8
2.1. Introduction 8
2.2. Materials and Methods 11
2.3. Results 19
2.3.1. Design of the 3D PNS disease microfluidic platform 19
2.3.2. Modeling of 3D MN demyelination by LPC treatment 26
2.3.3. Protein-level validation of SC dedifferentiation in the 3D demyelinating MN model 32
2.3.4. Reduced intracellular calcium level in the 3D demyelinating MN model 36
2.3.5. Modeling of 3D MN remyelination by Benz or MeCbl treatment 38
2.3.6. Ultrastructural analysis of demyelination and remyelination 42
2.4. Discussion 45
2.5. Conclusion 48
Chapter 3. Neuro-IMPACT: Modeling neural circuit, blood-brain barrier, and myelination on a microfluidic 96 well plate 49
3.1. Introduction 49
3.2. Materials and Methods 52
3.3. Results 59
3.3.1. Design and fabrication of the Neuro-IMPACT 59
3.3.2. Isolation of axons and protein analysis 63
3.3.3. Reconstruction of the 3D neural network 67
3.3.4. Reconstruction of the 3D Blood-brain barrier 69
3.3.5. Reconstruction of 3D myelin sheaths 73
3.4. Discussion 76
3.5. Conclusion 79
Chapter 4. U-IMPACT: A Universal 3D Microfluidic Cell Culture Platform 80
4.1. Introduction 80
4.2. Materials and Methods 83
4.3. Results 89
4.3.1. Design concept of the U-IMPACT 89
4.3.2. Measurement of platform material 91
4.3.3. Principle of patterning in the U-IMPACT 95
4.3.4. Liquid patterning in the U-IMPACT 96
4.3.5. The reconstruction of TME in the U-IMPACT 106
4.4. Discussion 114
4.5. Conclusion 117
Chapter 5. Conclusion 118
Bibliography 120
Abstract in Korean 130박
