Döme Lili

Haracska Lajos

Pintér Lajos

Zsigmond Eszter

SZTE Publicatio Repozitórium - SZTE - Repository of Publications

§| HAZAI TUDOMÁNYOS MŰHELYEK Haracska LajosAZ EVOLÚCIÓ MOTORJÁNAK VIZSGÁLATA; BETEKINTÉS AZ SZBK GENETIKAI INTÉZET MUTAGENEZIS ÉS KARCINOGENEZIS CSOPORT KUTATÁSAIBAA Mutagenezis és Karcinogenezis Kutatócsoport 2003-ban alakult Haracska Lajos vezetésével, a Szegedi Biológiai Kutatóközpont Genetikai Intézetében. Az akkori viszonylag szerény lehetőségek ellenére az intézet, különösen a Genetikai Intézet akkori igazgatója, Raskó István jelentős erőfeszítéseket tett, hogy olyan, külföldön már elismerést szerzett kutatókat vonzzon haza, akik új csoportok alapításával képesek kompetitiv, a tudomány élvonalába tartozó területeken kutatást folytatni. Ennek az elképzelésnek a Mutagenezis és Karcinogenezis Kutatócsoport és az érdeklődésének középpontjában álló DNS-hibajavítás tökéletesen megfelelt. Fő tudományos célként a mutációk kialakulásának sebességét és a karcinogenezist befolyásoló új gének és mechanizmusok felfedezése fogalmazódott meg.A laboratórium megalakulása óta három megközelítéssel dolgozik. Az első megközelítés a hangsúlyt a DNS-hibajavítás komplex rendszerének viszonylag egyszerű modellorganizmusban, az élesztőben (Saccharomyces cerevisae) történő megismerésére helyezi. E modellrendszer összetett genetikai eszköztárat biztosít, mely lehetővé teszi a különböző DNS- hibajavítási utaktanulmányozását. A DNS-hibajavítás nagyfokú hasonlóságot mutat, legyen szó egy- vagy többsejtű élőlényről, hiszen a hibás régiók eltávolítása vagy tolerálása létfontosságú minden élőlény túléléséhez. Az élesztőben feltérképezett útvonalak tehát jó iránymutatást jelentenek az emberben zajló folyamatok tanulmányozásához; az egyes élesztő fehérjék homológjai fellelhetők emberi sejtekben is.A laboratóriumban alkalmazott második megközelítés célja az élesztőben azonosított DNS hibajavító szereplők emberi megfelelőinek meghatározása, működésük humán sejtekben történő megismerése elsősorban sejtbiológiai módszerekkel vizsgálva. Ennek kapcsán a laboratórium rutinszerűen vizsgálja a DNS károsító ágensek (pl. számos tumorterápiás szer) humán sejtekre kifejtett hatását sejttúlélés, kromoszóma átrendeződés és mikroszkópos fehérje lokalizációs vizsgálatokkal, ugyanis a DNS-hibajavításban szerepet játszó fehérjék gyakran formálnak sejtmagi fókuszokat a DNS-károsító anyagokkal történő kezelés hatására. A kutatócsoport azonban jóval specifikusabb teszteket is végez, mint pl. a „Comet"-esszé, amely a sejtmagból gélelektroforézis hatására kivándorló DNS mérésével képes a DNS száltöréseket nyomon követni. Hasonlóan érdekes, és nagyon kevés laboratóriumban alkalmazott módszer azB IO K É M IAX X X IX . év fo lya m  2. szá m  2015 . jú n iu s19§| HAZAI TUDOMÁNYOS MŰHELYEK Haracska Lajosún. „DNS-fiber" technika, amellyel az egyedi replikációs villák haladási sebessége vizsgálható; kimutatható, ha egy adott DNS károsodás blokkolja a villa haladását, és új replikációs origók aktiválódása is pontosan vizsgálható.A laboratóriumban folyó munka harmadik ágát az előző két megközelítésből származó információk további vizsgálata, az újonnan azonosított fehérjék tisztítása és biokémiai aktivitásuk meghatározása jelenti. A laboratóriumban a technikai eszközök jelentős tárháza áll rendelkezésre, kezdve az egyszerűbb, fehérje-fehérje kölcsönhatásokat vizsgáló in vitro interakciós esszéktől a DNS polimerázok aktivitási vizsgálatán és a változatos helikáz aktivitást vizsgáló módszereken keresztül az in vitro ubikvitilációs esszékig.Ezt a háromlábú megközelítést alkalmazva születtek a csoport jelentősebb felfedezései, amelyek során elsőként írt le egy-egy új a DNS hibatoleranciában és karcinogenezisben szerepet játszó résztvevőt. Ezekre az alábbiakban kiragadunk néhány példát.A csoport 2006-ban és 2008-ban elsőként publikálta az élesztő Rad5 fehérje két humán megfelelőjének azonosítását az SHPRH és a HLTF fehérje leírásával. Ezek közül a HLTF fehérje az, amelyik azóta is szüntelen kutatási témát biztosít.A felfedezéshez a kiindulópontot az adta, hogy az élesztőben azonosított DNS- hibatolerancia útvonalak, illetve a bennük szerepet játszó fehérjék eukariótákban nagymértékben konzerváltak. A HLTF (Helicase like transcription factor) fehérje aminosav szekvencia szinten csak kismértékű homológiát mutat az élesztő Rad5 fehérjével. Felfedezéséhez inkább az vezetett, hogy az élesztő Rad5 fehérjéhez hasonlóan, a HLTF is rendelkezik SWI/SNF helikáz doménnel, RING finger doménnel és N-terminálisán található benne egy szekvenciaelem, a HIRAN dómén, ráadásul ezek a motívumok egy igen sajátos elrendeződést követnek. Irodalmi adatokból ismert volt, hogy a HLTF gén promotere metilálódik és így a fehérje nem fejeződik ki bizonyos tumorokban, ami arra utalt, hogy a fehérjének szerepe van a rákos elfajulások kialakulásának gátlásában, amely a DNS hibajavító fehérjék általános jellemzője.A funkcionális homológja bizonyításának egyik módja annak kimutatása volt, hogya HLTF fehérje képes menekíteni a Rad5 deléciós élesztőtörzs UV érzékenységét, azaz képes ellátni a Rad5 fehérje funkcióját a sejtekben.B IO K É M IAX X X IX . év fo lya m  2. szá m  2015 . jú n iu s20§| HAZAI TUDOMÁNYOS MŰHELYEK Haracska LajosKözvetlenebb bizonyítékként szolgált az, hogy a HLTF fehérje kölcsönhatásba tud lépni a Rad5 fehérje interakciós partnereivel, ui. bizonyítottuk, hogy a HLTF fehérje a DNS-hibajavítás és hibatolerancia már régóta ismert szereplőivel, a humán PCNA, Rád 18, Mms2 és Ubcl3  fehérjékkel működik egy komplexben.A funkcionális homológja bizonyításához in vitro rekonstruáltuk azt a nyolc fehérjéből álló rendszert, melynek keretein belül a HLTF fehérje ubikvitin ligázként működve, az élesztő Rad5 fehérjéhez hasonló módon, képes volt a DNS polimerázok processzivitási faktoraként ismert PCNA fehérje poliubikvitilálására.Azt, hogy a HLTF hogyan hat a replikációs villa stabilitására, a „DNS-fiber" módszerrel vizsgáltuk. A módszer lényege, hogy az éppen aktív replikációs villákat nukleotid analógok segítségével (Idll, CdU vagy BrdU) vizualizálhatjuk. A nukleotid analógok a szintézis során beépülnek a DNS-be, és megfelelő fluoreszcens ellenanyag segítségével kimutathatók. A módszer segítségével bizonyítottuk, hogy a HLTF fehérje hiánya a replikációs villa elakadásához, annak töréséhez és genomikus átrendeződésekhez vezethet (1. ábra).i m a s1au M Jmm> ■ m m_ _ _ _ t — 11. ábra. A HLTF fehérje hiánya a replikációs villa elakadásához vezethet. „DNS-fiber" módszer segítségével megjelölhetőek az éppen aktív replikációs villák nukleotid analógok segítségével. Az IdU (jóddeoxiuridin) és a BrdU (brómdeoxiuridin) a megkettőződés során beépül az újonnan szintetizálódó DNS-szálba, amely fluoreszcens ellenanyag segítségével vizualizálható. Ennek a technikának köszönhetően mutattuk ki, hogy HLTF hiányában és MMS (metilmetán szulfonát) DNS-károsító ágenssel történő kezelés után a replikációs villa elakad, mert a replikációs apparátus nem képes túljutni a hibás szakaszon.A Mutagenezis és Karcinogenezis kutatócsoport másik jelentősebb felfedezése 2007-ben szintén az élesztő Rad5 fehérjéhez kapcsolódott. A Rad5 fehérjében található SWI/SNF2 családra jellemző helikáz motívumok arra utaltak, hogy szerepet játszhat az elakadt replikációs villa egy korábban csak elméleti lehetőségként felvetett, „csirkeláb" jellegű struktúrán keresztüli mentéséhez, így biztosítva a károsodott bázisok hibamentes, mutációt nem okozó átírását.B IO K É M IAX X X IX . év fo lya m  2. szá m  2015 . jú n iu s21§| HAZAI TUDOMÁNYOS MŰHELYEK Haracska LajosAhhoz, hogy ezt az aktvitást ki tudjuk mutatni, szükség volt a replikációs villa modellezésére és in vitro rekonstruálására, amelyet oligonukleotidokból álló, illetve egy plazmid méretű villa létrehozásával oldottunk meg.A kísérletek nemcsak azt bizonyították, hogy a Rad5 fehérje képes a replikációs villa visszafordítására, hanem azt is, hogy az általános helikázoktól eltérő módon ezt nem az egyszálú DNS-en közlekedve, a szálak szétválasztásával éri el, hanem a kettős szálú DNS-en haladva, a replikációsvilla vezető- és lemaradó szálának egyidejű szétválasztásával és ezzel szinkronban történő összehibridizálásával teszi, egyszálú köztes termék létrejötte nélkül. Ugyanezt az aktivitást később, a kutatócsoport munkafolyamatának megfelelően, a HLTF fehérjéről is bizonyítottuk (2. ábra).2. ábra. A RadS fehérje replikádé villa-visszafordító aktivitással rendelkezik. Biokémiai módszerekkel kimutatható, hogy a Rad5 fehéjre képes visszafordítani a replikációs villát, azaz szerepet játszik a DNS-hibatolerancia útvonalban. A DNS-károsodás következtében megállt replikáció folytatását úgy segíti elő, hogy helikáz aktivitása révén visszafordítja a replikációs villát, elősegíti a templátváltás folyamatát, melynek köszönhetően replikatív polimeráz számára az újonnan szintetizált hibamentes DNS-szál szolgál mintaként a másoláshoz.Természetesen a fentebb vázolt megközelítéseken kívül gyakran használjuk új szereplők azonosítására az elérhető bioinformatikai módszereket is. így fedeztük fel, hogy a laboratórium által mélyrehatóbban vizsgált DNS-hibatolerancia útvonalban jelentős számban vesznek részt olyan fehérjék, melyek az ubikvitin- kötő domének egy speciális változatát, a C2HC motívummal rendelkező UBZ domént tartalmazzák. Ebből arra következtettünk, hogy a folyamat szabályozásában jelentős szerepet játszó ubikvitinnek egy olyan felszíne exponált a DNS-hibatolerancia során, amely azonosítására ez a dómén kifejezetten alkalmas lehet.B IO K É M IAX X X IX . év fo lya m  2. szá m  2015 . jú n iu s22§| HAZAI TUDOMÁNYOS MŰHELYEK Haracska LajosEnnek felismerése után sikerült további C2HC-típusú potenciális ubikvitin- kötőfehérjéket azonosítanunk, amelyekről még nem voltak publikációk. Ezek egyike volt a laboratóriumunk által nemrég leírt és jellemzett Spartan fehérje, amely evolúciósán konzervált PIP- (PCNA Interacting Protein), UBZ- (Ubiquitin Bindig Zinc-finger) és SprT-proteáz-doménnekkel rendelkezik (3. ábra).SprT P1P UBZ. I I  I II I I  «SpananWRNTPI RADÍR Fám / nrhU B Z  domain3. ábra. A Spartan fehérje doménszerkezete. A Spartan három funkcionális doménnel rendelkezik: egy SprT metalloproteáz doménnel, melynek funkciója még ismeretlen, egy PIP PCNA interekciós motívummal, illetve egy UBZ ubikvitinkötő cink ujj-doménnel. Ez utóbbi igen gyakran előfordul a DNS-hibajavításban szerepet játszó fehérjékben.Kimutattuk, hogy a Spartan DNS károsodás esetén (pl. UV sugárzás) az ubikvitilált PCNA-hoz kötődik (4. ábra) és ezzel a genom stabilitásának a megőrzésében vesz részt, feltételezhetően a replikációs- és transzléziós polimerázok kicserélődését szabályozva. A polimeráz csere megvalósulásakor a replikáció tovább tud folytatódni és nem alakulnak ki száltörések, ui. a transzléziós polimerázok, amelyek flexibilisebb aktív centrummal rendelkeznek, képesek a DNS károsodásokkal szemben is nukleotid beépítésre. Ilyen transzléziós enzim például a polimeráz H, amely az UV-sugárzás hatására keletkező T-T dimerekkel szemben képes a megfelelő nukleotidokat beépíteni. A folyamat fontosságát mutatja, hogy a polimeráz n génjének mutációja egy bőrrákra erősen hajlamosító genetikai betegséget, a Xeroderma pigmentosum variáns formáját okozza és a Spartan- ról nemrégiben derült ki, hogy mutációja májrák kialakulására hajlamosít.A Mutagenezis és Karcinogenezis Kutatócsoport az MTA SzBK legnagyobb kutatócsoportjai közé tartozik. Az egyetemi- és Ph.D. hallgatók részéről megnyilvánuló állandó érdeklődés, valamint a kompetitív terület folyamatosan biztosítja a megfelelő bázist és az új kísérleti irányokat a csoport működéséhez. A heti rendszerességgel történő munkamegbeszélések és ötletbörzék pedig kifogyhatatlan tárházát jelentik a több évtizedre elegendő új kísérletnek (5. ábra).B IO K É M IAX X X IX . év fo lya m  2. szá m  2015 . jú n iu s23HAZAI TUDOMÁNYOS MŰHELYEK Haracska Lajos4. ábra. A Spartan fehérje lokalizációja a sejtekben. A Spartan UV-sugárzás hatására a károsodás helyére, az elakadt replikációs villához lokalizálódik a sejtmagban sejtmagi fókuszokat formálva. A lokalizációjához nélkü-lözhetetlen az UBZ és a PIP doménje, mellyekkel az ubikvitilált PCNA fehérjéhez kapcsolódik.5. ábra. A Mutagenezis és Karcinogenezis Kutatócsoport.Szerzők:Döme Lili, Ph.D. hallgató, dome.lili@brc.mta.huPintér Lajos, tudományos ügyintéző, pinter.lajos@brc.mta.huZsigmond Eszter, Ph.D. hallgató, zsigmond.eszter@brc.mta.huHaracska Lajos, tudományos tanácsadó, csoportvezető, haracska.lajos@brc.mta.huBIOKÉMIAXXXIX. évfolyam 2. szám 2015. június24

Az evolúció motorjának vizsgálata; betekintés az SZBK Genetikai Intézet mutagenezis és karcinogenezis csoport kutatásaiba

http://publicatio.bibl.u-szeged.hu/8218/1/Biokemia.pdf

Az evolúció motorjának vizsgálata; betekintés az SZBK Genetikai Intézet mutagenezis és karcinogenezis csoport kutatásaiba

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

SZTE Publicatio Repozitórium - SZTE - Repository of Publications