thesis

Identyfikacja czynników stymulujących fototoksyczne działanie melaniny z nabłonka upigmentowanego siatkówki

Abstract

Główną funkcją komórek nabłonka upigmentowanego siatkówki jest utrzymanie w dobrym stanie komórek fotoreceptorowych, co umożliwia prawidłowy proces widzenia. Warunki fizykochemiczne panujące w siatkówce, a mianowicie duże stężenia tlenu i substancji światłoczułych przy jednoczesnej ekspozycji na światło, sprzyjają zaistnieniu reakcji fotouczulanych z udziałem reaktywnych form tlenu. Komórki RPE wyposażone są w szereg czynników obrony przed stresem oksydacyjnym, wśród których występuje melanina zawarta w melanosomach. Warstwa komórek RPE jest tkanką postmitotyczną, więc nie ma możliwości regeneracji poprzez wymianę komórek. Melanina w komórkach RPE syntetyzowana jest w dużych ilościach jedynie w życiu płodowym, pojawiające się z wiekiem zmiany w melaninie kumulują się. W pracy badano wpływ wieku na właściwości przeciw- i proutleniające melanosomów ludzkich. Zaobserwowano wyraźny wzrost fotoreaktywności melanosomów z wiekiem dawców, objawiający się zwiększoną konsumpcją tlenu oraz produkcją anionorodnika ponadtlenkowego, obserwowanych odpowiednio za pomocą tlenometrii EPR oraz pułapkowania spinowego. Oprócz pomiaru całych ziarnistości, badano właściwości różnych części składowych melanosomu. Detekcję reaktywnych form tlenu generowanych przez rozpuszczalną w chloroformie składową melanosomów prowadzono przy użyciu HPLC z detektorem elektrochemicznym. Chloroformowe ekstrakty z melanosomów, umieszczone w peroksydowalnych liposomach wykazywały zwiększoną generację reaktywnych form tlenu, głównie tlenu singletowego. Celem przeprowadzenia dokładniejszych badań zmian właściwości melaniny posłużono się układem modelowym : postarzanymi światłem melanosomami zwierzęcymi. Badano sam proces fotodegradacji melanosomów zwierzęcych światłem niebieskim oraz zmiany właściwości melaniny temu towarzyszące. Posługując się spektroskopią EPR obserwowano zwiększenie produkcji anionorodnika ponadtlenkowego przez naświetlane mealnosomy. Badano w jaki sposób degradacja melanosomów wpływa na zdolność hamowania reakcji Fentona. Stwierdzono znacznie mniejszą zdolność kompleksowania jonów metali przejściowych, co może mieć wpływ na ogólną homeostazę oksydoredukcyjną w komórce. Aby potwierdzić zmiany właściwości przeprowadzono doświadczenia na hodowlach komórkowych, podając komórkom ARPE-19 melanosomy natywne i degradowane. Zaobserwowano znaczący wzrost fototoksyczności melanosomów poddanych fotostarzeniu w porównaniu z melanosomami natywnymi. W doświadczeniach nad molekularnym mechanizmem zaobserwowanych zjawisk badano zmiany struktur wewnętrznych melanosomów posługując się wpływem jonów Dy(III) na szybkość relaksacji spinowo-siecowej centrów paramagnetycznych melaniny. Stosując impulsową spektroskopię EPR udało się zaobserwować zwiększony wpływ jonów na czas relaksacji dla melanosomów degradowanych, co może wskazywać na rozluźnienie struktur polimeru melaniny. Stwierdzono też zwiększony potencjał fotoredukcyjny melanosomów fotodegradowanych w nieobecności tlenu. Melanosomy degradowane znacznie szybciej redukowały znacznik spinowy pod wpływem światła. Zaobserwowano także zmiany charakterystycznego sygnału EPR melaniny, mierzonego w zaawansowanym technicznie paśmie W, pod wpływem fotodegradacji. Może to sugerować zmianę geometrii wokół centrów paramagnetycznych melaniny. Uzyskane obserwacje potwierdzają znaczący wzrost fotoreaktywności melanosomów ludzkich wraz z wiekiem. Doświadczenia na postarzanych światłem melanosomach zwierzęcych potwierdzają tą hipotezę, jak również pozwalają wyciągnąć wnioski na temat zmian właściwości melaniny. Najprawdopodobniej struktura wewnętrzna w cząsteczce melaniny ulega rozluźnieniu, co skutkuje łatwiejszym dostępem zewnętrznych reagentów do wolnorodnikowych centrów melaniny i mniejszą zdolnością do przechwytywania jonów metali przejściowych. Natywne melanosomy w zależności od warunków doświadczalnych mogą wykazywać właściwości zarówno pro- jak i antyutleniające. Wraz z postępującym procesem fotodegradacji zaczyna dominować aktywność proutleniająca przy jednoczesnym spadku wydajności procesów przeciwutleniajacych. Efekty te mogą sprzyjać występowaniu zaburzeń procesu widzenia, prowadząc do patologii siatkówki takich jak starcze zwyrodnienie plamki żółtej (AMD)

    Similar works