Cerezo , A.

Hernández, P. J.

Medina, M. M.

Sánchez, J.

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SISTEMAS DE TRANSPORTE Y LIBERACION DE FARHACOS: ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE HICROESFERAS LIPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORINA A. P.J. Hernández, M. M. Medina, A. Cerezo y J. Sánchez. Dpto. Farmacia y Tecnología Farmacéutica. Cátedra de Farmacia Galénica. Universidad de Granada. España. INTRODUCCION Dentro de los nuevos sistemas de transporte y liberación de fármacos destacan las microesferas lipídicas, debido sobre todo a las numerosas ventajas que presentan frente al resto. Conviene señalar, entre otras, su elevada estabilidad, la amplia experiencia clínica que existe-en el uso de emulsiones grasas de administración intravenosa, así como la posibilidad de poder ser elaboradas a gran escala. Estos sistemas de tamaño de micropartícula, caracterizados como emulsiones de fase externa acuosa (O/A), han servido para la incorporación de numerosos principios activos. Así, MIZUSHIMA y cols. han encapsulado diversos antiinflamatorios tanto de naturaleza esteroídica (dexametasona) (1982), como no esteroídica (indometacina) (1983 a), prostaglandinas bronco y vasodilatadoras (PGE¡) (1983 b) Y agentes citostáticos (1986). Nuestro objetivo ha sido la incorporación a microesferas de lípidos de un fármaco de acción inmunosupresora ampliamente utilizado en la terapéutica clínica actual, la ciclosporina A. Se trata de una molécula catalogada como de índice terapéutico bajo, manifestando además numerosas diferencias interindividuales en sus parámetros farmacocinéticos. Pero es sobre todo su elevada nefrotoxicidad (KOREN, 1989), lo que aconseja la modificación de su forma de administración, al objeto de mejorar su biodisponibilidad, seguridad y eficacia. Tras un estudio exhaustivo sobre la incorporación de dicho principio activo a esta modalidad de microesferas, y obteniendo en todos los casos unos porcentajes de encapsulación cercanos al 90 % (HERNANDEZ y cols. , 1991), se ha evaluado la estabilidad a temperatura ambiente de cuatro formulaciones diferentes de microesferas lipídicas portadoras de ciclosporina A durante un periodo de tiempo de 90 días. 175 MATERIAL Y HETODOS En el Cuadro 1 aparecen recogidas las cuatro formulaciones seleccionadas para el estudio de estabilidad. Se indica s,u conposición, la concentración de sus diversos componentes en g/lOO ml, así como la proporción (P/P) de aceite de soja/lecitina de soja. En todas ellas, la concentración inicial de ciclosporina A ( Sandoz) es constante e igual a 0,020 g/lOO ml. Como integrantes de las diferentes formulaciones figuran: acei te refinado de soja (Campi Jove), leci tina de soja (J. Escuder), colesterol (Merck), tween 80 (Glyco Ibérica) y glicerina (Campi Jove). Las formulaciones han sido seleccionadas en base a los resultados obtenidos tras la normalización del método de obtención de microesferas lipídicas (HERNANDEZ y cols. , 1989 a) y el estudio de la encapsulación de ciclosporina A (HERNANDEZ y cols. , 1991). La fórmula número 1, corresponde a la de menor tamaño de partícula. La número 2 es la que mayor porcentaje de principio activo encapsuló recien elaborada. Con la número 3 se pretende evaluar la influencia del colesterol sobre la estabilidad de las microesferas, y con la fórmula número 4, la influencia conjunta del colesterol y del tween 80. El método de obtención seguido es el previamente normalizado (HERNANDEZ y cols. , 1989 a) y basado en la técnica descrita por MIZUSHIMA y cols. (1982) para la elaboración del IntralipidR 10 %. En primer lugar, se solubilizan por separado los componentes de ambas fases (fase acuosa y fase oleosa),incorporando la ciclosporina junto a todos los componentes de la fase oleosa. La interposición se realiza con el empleo de un agitador mecánico (Omni mixer; Sorvall; modelo 230), a la velocidad inicial de 10000 rpm/30 seg y posteriormente 4000 rpm/15 mino La emulsión así obtenida se homogeniza haciéndola atravesar membranas filtrantes de 1,2 �m de diámetro de poro. Con el fín de evaluar la estabilidad de las microesferas, las cuatro formulaciones se mantienen a temperatura ambiente durante 90 días. A intervalos de 10 días, se toman muestras para su separac�on mediante cromatografía de exclusión molecular, empleando un gel de dextrano ( Sephadex G-50 fino; Pharmacia Fine Chemicals) como fase estacionaria y agua destilada com fase móvil. La monitorización del proceso separativo se efectúa en un espectrofotómetro UV-Vis (Perkin Elmer; Hi tachi; modelo 124) 176 provisto de célula de flujo continuo a 210 nm. La fracción de ciclosporina A libre es recogida y solubilizada en cantidad suficiente de etanol para su valoración espectrofotométrica. Por diferencia entre el porcentaje encapsulado el día cero y los obtenidos en días sucesivos, se puede determinar el porcentaje de ciclosporina captado perdido en función del tiempo. RESULTADOS Los resultados obtenidos tras el estudio de la estabilidad de las muestras de microesferas de ciclosporina A, mantenidas a temperatura ambiente durante 90 días, figuran en los Cuadros 2-5. En ell�s se indican los porcentajes de principio activo captado, experimental y teórico, así como el porcentaje perdido, a lo largo del periodo de estudio. Los valores experimentales de ciclosporina A captada corresponden a la media arimética de cinco determinaciones, incluyéndose las desviaciones estándar de los mismos. Las representaciones A perdido en función formulaciones estudiadas, gráficas del porcentaje de ciclosporina del tiempo para cada una de las se corresponden con las Figuras 1-4. LaS figuras 5-8 ofrecen las representaciones gráficas de los procesos cinéticos de degragación de las diferentes formulaciones ensayadas. Además, se incluye la ecuación que rige el proceso, la constante de degradación y los coeficientes de correlación lineal, experimentales y teóricos. DISCUSION En una primera aproximación, se puede indicar que no se han producido pérdidas elevadas de ciclosporina A encapsulada, a lo largo del periodo de estudio. Sin embargo, y aunque las diferencias observadas entre las cuatro formulaciones ensayadas no son considerables, sería importante destacar los resultados derivados de la presencia o no de tween 80 en la composición de las microesferas. Comparando los datos experimentales proporcionados por las fórmulas número 1,2 Y 4 (Cuadros 2,3 Y 5 respectivamente), se deduce un cierto efecto negativo del tween 80 sobre la estabilidad de estos sistemas. Su incorporación, a una concentración de 0,50 g/lOO mI de emulsión (fórmula 1) origina pérdidas de principio activo encapsulado superiores a las 177 constatadas en aquellas muestras que no lo incluyen (fórmul�s 2 y 4). Así, transcurridos 90 días desde la preparación, las microesferas lipídicas obtenidas de acuerdo con la fórmula número 1 liberaron el 17,28 % del agente inicialmente encapsulado. Para las fórmulas número 2 y 4, dicha liberación fue del 10,19 % y del 12,87 %, respectivamente. Estos resultados coinciden con los obtenidos tras el estudio de la estabilidad de microesferas lipídicas portadoras de vitamina � (HERNANDEZ y cols., 1989 b). Por otro lado,la fórmula número 3 (Cuadro 4) caracterizada por no contener colesterol, experimenta una pérdida de ciclosporina A a los 90 días de iniciado el estudio (16,68 %), similar a la observada en las microesferas elaboradas con 0,50 g de colesterol/lOO ml de emulsión e idénticas cantidades del resto de componentes que la anterior (fórmula 1, Cuadro 2). No obstante, al prescindir conjuntamente de colesterol y tween 80 en el momento de la preparación (fórmula 4), se aprecia una ligera disminución en el porcentaje de agente perdido a los 90 días (12,87 %). El posible colesterol, en efecto ausencia estabilizante de tween 80, determinado constatado por para el las microesferas portadoras de vitamina K3, no aparece tan claro en este caso. En efecto, si se consideran los resultados aportados por las muestras sin tween 80, diferenciadas por la incorporación o no de colesterol (fórmulas 2 y 4, respectivamente), el porcentaje final de agente perdido varía tan sólo del 10,19 % al 12,87 %. Sin embargo, a partir del día 40, la liberación se intensifica en las microesferas lipídicas elaboradas únicamente con aceite: lecitina (1:1,8 P/P) y glicerina (fórmula 4, Cuadro 5), en comparación con aquellas que también incluyen colesterol (fórmula 2, Cuadro 3). Las diferencias más representativas se producen entre las formulaciones que contienen tween 80 (fórmulas 1 y 3) y las que no lo incluyen en su composición (fórmulas 2 y 4). En base a los datos del estudio de la cinética de degradación de las microesferas de ciclosporina A, se ha podido comprobar como el proceso de inestabilidad de las microesferas elaboradas de acuerdo con las fórmulas 1,2 y 4 (Figuras 5,6 y 8), está regido por una ecuación de orden cero. En cambio, la fórmula número 3, caracterizada por incluir tween 80 en su composición, pero no colesterol, ha presentado una liberación de principio activo irregular, apreciándose a primera vista una elevada pérdida de 178 agente encapsulado nada más iniciarse el datos no se ajustan totalmente a una (Figura 7), ni tampoco de orden uno. estudio (Figura 3). Los cinética de orden cero Como conclusión final, en base a los resultados discutidos, la formulación más idónea para el transporte y liberación de ciclosporina A en microesferas lipídicas es la constituída por aceite de soja:lecitina de soja en relación 1: 1,8 (P/P), colesterol (0,50 g/lOO ml) y glicerina (0,63 g/lOO ml). Dicha fórmula es la que ha presentado un mayor porcentaje de agente activo captado (94,09 ± 2,87 %), perdiendo tan sólo el 10,19 % a los 90 días de su elaboración. BIBLIOGRAFIA HERNANDEZ, P.J. , MEDINA, M. M. , CEREZO, A. y SANCHEZ, J. 1989 a. Microesferas lipídicas: Método de obtención y caracterización. Pharmaklinik, Vol. nQ 3(4): 163-167. HERNANDEZ, P. J. , MEDINA, M. M. , CEREZO, A. Y SANCHEZ, J. 1989 b. Sistemas de transporte y liberación de fármacos: Estudio de la estabilidad de microesferas lipídicas. Comunicación presentada al XXXIV Congreso Nacional de la S.E. F. H. León. HERNANDEZ, P. J. ,  MEDINA, M. M. , CEREZO, A. Y SANCHEZ, J. 1991. Microesferas lipídicas: Estudio de la· encapsulación de ciclosporina A. Comunicación presentada al IV Congreso Internacional de Ciencias Farmacéuticas. Barcelona. KOREN, G. 1989. Nephrotoxic potential of drugs and chemicals: Pharmacological basis and clinical revelance. Medical Toxicology. Vol. nQ 4: 59-72. MIZUSHIMA, Y., HAMANO, T. y YOKOYAMA, K. 1982. Use a lipid emulsion as a novel carrier for corticosteroids. J. Pharm. Pharmacol. Vol. nQ 34: 49-50. MIZUSHIMA, Y. , HAMANO, T. y YOKOYAMA, K. 1983 a. Anti­infflamatory effects of indomethacin ester incorporated in a lipid microsphere. J. Pharm. Pharmacol. Vol. nQ 35: 398-399. MIZUSHIMA, Y. , YANAGAWA, A. y HOSHI, K. 1983 b. Prostaglandin El is more effective when incorporated in lipid microspheres, for treatment of peripheral diseases in mano J. Pharm. Pharmacol. Vol. nQ 35: 666-667. MIZUSHIMA, Y. , SHOJI, Y. , KATO, T., FUKUSHIMA, M. y KUROZUMI, S. 1986. Use a lipid microspheres as a drug carrier for antitumour drugs. J. Pharm. Pharmacol. Vol. nQ 38: 132- 134. 179 NUESTRA (nQ) 2 cuno 1 fOlIULACIOIES ELABORADAS PARA EL ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE IICiOESFEIAS LIPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORIIA A FORMULACION AS-LS-CH-TW-GL-Cs A AS-LS-CH-GL-Cs A AS-LS-TW-GL-Cs A AS-LS-GL-Cs A PROPORCION AS: LS (p /p) 1: 1 ,8 1: 1 ,8 1: 1 , 8 1: 1 ,8 CONCENTRACION (g/lOO Il) AS LS CH TW GL Cs A 0,685 1,25 0,50 0,50 0,63 0,020 0,685 1,25 0,50 0,63 0,020 0,685 1,25 0,50 0,63 0,020 0,685 1,25 0,63 0,020 AS: Aceite de soja; LS: Lecitina de soja; CH: Colesterol; TW: Tween 80; GL: Glicerina; Cs A: Ciclosporina A. 180 DlA o 10 20 30 40 50 60 70 80 90 CUADIO 2 ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE IICIOESrERAS LIPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPOIIIA A FORMULA NUMERO 1 ( n:5 1 PORCENTAJE Cs A PORCEMTAJE Cs A CAPTADO EXPERIMENTAL CAPTADO TEORICO (�l (�l 86,81 ± 3,H 100 84,37 ± 4,67 97,19 85,97 ± 8,36 99,03 82,89 ± 3,32 95,48 77,59 ± 2,59 89,38 77,27 ± 4,H 89,01 76,76 ± 8,70 88,42 75,16 ± 7,80 86,58 72,31 ± 9,03 83,30 69,53 ± 7,78 80,09 18 1 PORCEIlTAJE Cs A PERDIDO (�l O 2,H 0,84 3,92 9,22 9,54 10,05 11,65 14 ,50 17,28 DIA ° 10 20 30 40 50 60 70 80 90 CUADRO 3 ISTUDIO DI LA ISTABILIDAD DI IIClOlSrlRAS LIPIDICAS PORTADORAS DI CICLOSPOIIIA A FORMULA NUMERO 2 (n:5) PORCENTAJE Cs A PORCENTAJE Cs A CAPTADO EXPERIMENTAL CAPTADO TEORICO (1) (1) 94,09 ± 2,87 100 95,63 ± 3,18 100 93,23 ± 5,'27 99,09 88,72 ± 5,19 94,29 90,07 ± 3,24 95,73 85,18 ± 3,16 90,53 90,07 ± 3,32 95,73 88,14 ± 2,65 93,68 86,19 ± 6,72 91,60 83,90 ± 4,27 89,17 182 PORCENTAJE Cs A PERDIDO (1) ° ° 0,86 5,37 4,02 8,91 4,02 5,95 7,90 10,19 DlA ° 10 20 30 40 50 60 70 80 90 CUADIO 4 ISTUDIO DI LA ISTABILIDAD DI IICIOIS'IIAS LIPIDICAS PORTADORAS DI CICLOSPOIIIA A FORKULA NUKERO 3 (n=5) PORCENTAJE Cs A PORCENTAJE Cs A CAPTADO EXPERlKENTAL CAPTADO TEORlCO (1) (1) 86,80 ± 3,82 100 14 ,31 ± 1,89 85,61 79,06 ± 11,40 91,08 69,04 ± 11,10 79,54 68,16 ± 10,08 78,53 72,46 ± 9,60 83,48 76,32 ± .  8,92 87,93 77,63 ± 9,89 89,H 70,84 ± 8,68 81,61 70,12 ± 7,69 80,78 183 POiCENTAJE Cs A PERDIDO (1) ° 12,49 7,14 17,76 18,64 14,34 10,48 9,17 15,96 16,68 DIA ° 10 20 30 40 50 60 70 80 90 cuno 5 ESTUDIO DK LA KSTABILIDAD DK IICIOKSFKRAS LIPIDICAS PORTADORAS DK CICLOSPORIIA A FORMULA NUMERO 4 (n=5! PORCENTAJE Cs A PORCENTAJE Cs A CAPTADO EXPERIMENTAL CAPTADO TEORICA (�! (�! 91,81 ± 2,42 100 91,54 ± 3,58 99,71 91,22 ± 5,92 99,36 88,78 ± 3,97 96,70 84,04 ± 7,15 91,54 82,31 ± 6,07 89,65 79,55 ± 8,44 86,65 81,81 ± 9,82 89,11 80,04 ± 9,14 87,18 78,94 ± 7,80 85,98 184 PORCENTAJE Cs A PERDIDO (�! ° 0,27 0,59 3,03 7,77 9,50 12,26 10,00 11,77 12,87 FIGURA 1 ESTABILIDAD DE MICROESFERAS LlPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORINA A Ciclosporina A perdida (%) 20,-------------------------------------------------� - F6rmula 1 I 15 10 5 O�--�----�----�----�----�----�--��--�----� O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tiempo (días) 185 FIGURA 2 ESTABILIDAD DE MICROESFERAS LlPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORINA A Ciclosporina A perdida (%) 20 . - Fbrmula 21 15 10 5 O�--�----�----�----�--�----�----�----�--� O 10 20 80 40 50 60 70 80 90 Tiempo (días) 186 FIGURA 3 ESTABILIDAD DE MICROESFERAS LIPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORI NA A Ciclosporina A perdida (%) 20�------------------------------------------------� - Fórmula 31 15 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tiempo (días) 187 FIGURA 4 ESTABILIDAD DE MICROESFERAS LlPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORINA A Ciclosporina A perdida (%) 20.-------------------------------------------------� - F6rmula 41 15 10 5 O L-==�== __ -L ____ � __ �L_ __ � ____ _L ____ � ____ L_ __ � O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tiempo (días) 188 FIGURA 5 ESTUDIO CINET ICO DE M. LlPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORINA A CiClosporina A captada (%) 100��----------------------------------------------� 90 80 70 o . 10 20 � Fórmula 1 I 30 40 50 60 Tiempo (días) 70 80 - Ecuación de la recta: Y = 100,6722 - 0,2183.X Cte. degradación: - 0,2183 - Coef. correlación experimental: - 0,9737 - Coef. correlación teórico: 0,8783 (0,05) Y 0,9587 (0,01) 189 90 FIGURA 6 ESTUDIO CINET ICO DE M. LlPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORINA A Ciclosporina A captada (%) 100����-------------------------------------------' 90 80 70 o 10 20 � F6rmul. 21 30 40 50 60 Tiemp (días) 70 80 - Ecuación de la recta: Y = 100,0056 - 0,1116.X - Cte. degradación: - 0,1116 - Coef. correlación experimental: - 0,8708 - Coef. correlación teórico: 0,8783 (0,05) Y 0,9587 (0,01) 190 90 FIGURA 7 ESTUDIO CINET ICO DE M. LlPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORINA A Ciclosporina A captada (%) 100�--------------------------------------------------� 90 80 70 o 10 20 � F6rmula 31 30 40 50 60 Tiempo (días) 70 80 - Ecuación de la recta: Y = 90,6834 - O,1085.X - Cte. degradación: - 0,1085 - Coef. correlación experimental: - 0,5007 - Coef. correlación teórico: 0,8783 (0,05) Y 0,9587 (0,01) 19 1 90 FIGURA 8 ESTUDIO CINET ICO DE M. LlPIDICAS PORTADORAS DE CICLOSPORINA A Ciclosporina A captada (%) 100�-=��--�--------------------------------------� 90 80 70 o 10 20 � FOrmula 41 30 40 50 60 Tiempo (días) 70 80 - Ecuación de la recta: Y = 100,6929 - 0,1801.X - Cte. degradación: - 0,1801 - Coef. correlación experimental: - 0,9470 - Coef. correlación teórico: 0,8783 (0,05) y 0,9587 (0,01) 192 90 

Sistemas de transporte y liberación de fármacos: estudio de la estabilidad de microesferas lipídicas portadoras de ciclosporina A

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