The fluorescence quenching of carbazole by tropanic alkaloids in ciclohexane has been studied in the steady-state. The results obtained supports hydrogen-bond formation both in the ground and excited states. The values of the equilibrium constants are Kg 18.0 M-1 Y 158 &lt; Ke &lt; 430 M-1 both for the ground and excited states respectively.La desactivación de la fluorescencia del carbazol por alcaloides tropánicos en ciclohexano ha sido estudiada en estado estacionario. Los resultados obtenidos indican la formación de un complejo por enlace de hidrógeno tanto en el estado fundamental como en el excitado. Los valores de las constantes de equilibrio son Kg = 18.0 M-1 y 158 &lt; Ke &lt; 430 M-1 para el estado fundamental y el excitado respectivamente

Alvarez, J. M.

Jiménez, M.

Quintero, B.

Talavera, E. M.

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ARS PHARMACEUTICA REVISTA DE LA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE GRANADA Tomo XXXI Núms. 3 - 4 1990 Directo¡;: Prof. Dr. D. Jesús Cabo Torres Director Ejecutivo: Prof. Dr. D. José Luis Valverde Secretario General: Prof. Dr. D. José Jiménez Martín Consejo de Redacción: D. Manuel Casares Porcel D: M.a Teresa Correa Sánchez D: M: José Faus Dader D. Jesús González López D.a M: del Mar Herrador del Pino D. Eduardo Ortegá Bernaldo de Quirós Secretario de Redacción: D. José Luis Campos Alvarez Redacción y Administración: Facultad de Farmacia Granada - España Dep. Legal: GR. núm. 17-1960 ISSN 004-2927 Imprime: Servicio de Publicaciones Colegio Máximo de Cartuja Universidad de Granada Sumario TRABAJOS ORIGINALES DE LA FACuLTAD • Amortiguación de la fluorescencia del carbazol por alcaloides tropánicos (1), por Talavera, E. M.; Quintero, B.; Jiménez, M. y Alvarez, J. M . ............ . • Amortiguación de la fluorescencia del carbazol por alcaloides tropánicos (11), por Talavera, E. M.; Quintero, B.; Jiménez, M. y Alvarez, J. M . ............ . • Plantas utilizadas en medicina popu­lar en la comarca de Baza, por Negrillo Galindo, A. M.; Aroza Montes, P. y Cobo Gómez, D . .............................. . • Una botica de Murcia del s. XVIII, por Arrebola Nacle, P. y López Andújar, G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . • Contaminación de aguas por pestici­das, por Jiménez, M.; Talavera, E. M.; Alvarez, J. M. Y Quintero, B . ............ . • Lactonas sesquiterpénicas en el gé­nero Achillea, por Fernández Barrero, A.; Alvarez-Manzaneda Roldán, E. J. Y Alvarez-Manzaneda Roldán, R . .... . • Estudio oscilopolarográfico del ácido picrolónico, por Jara, V.; Crovetto, L.; González, R. M. Y Martínez, 1. ......... . 143 151 157 100 175 181 191 • Determinación de los coeficientes de control de flujo en un tramo acotado de la ruta glucolítica, por Sola, M. M.; Oliver, J.; Salto, R.; Gutiérrez, M. y Vargas, A. M. .................................... 197 • Valoración espectrofotométrica de nitritos en agua, por Fernández, M. P.; Jiménez, M. y Quintero, B. ............... 4J1> • Efecto de la refrigeración sobre la maduración del fruto del chirimoyo, por Lahoz, J.; Gutiérrez, M.; Martínez­Cayuela, M.; Pascual, L y Vargas, A. M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  211 • Cinética de descomposición de peni­cilinas sintéticas, por Jiménez, M.; Es-calera, B. y Sellés, E. ........ ....... ... ..... 217 • Pervivencia de la zarzaparrilla en textos médico-farmacéuticos españo­les, por Fernández Negri, M. A. y·López Andújar, G. ....................................... 223 • Cinética de descomposición de la cloxacilina sódica, aplicación de mé­todos estadísticos al tratamiento de datos cinéticos, por Jiménez, M.; Es-calera, B. y Martín, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . 2D • Cumarinas en especies del género seseli (fam. umbelliferae), por Barrero, A. F.; Herrador, M. M. Y Arteaga, P. . 241 .Estudio de N-carboximetil-L-fenilalanina y de su clorhidrato monohidrato por, Abarca García, M. E., González Pérez, J. M.; González García, S. y Niclós Gutiérrez, J. . . . . . . .  251 BIBLlOGRAFIA • Crítica de libros . . . . .  ....... ............... ...... 2f31 DEPARTAMENTO DE QUIMICA FISICA UNIVERSIDAD DE GRANADA AMORTIGUACION DE LA FLUORESCENCIA DEL CARBAZOL POR ALCALOIDES TROP ANICOS (1) Talavera E. M., Quintero B., Jiménez M., Alvarez J. M. RESUMEN La desactivación de la fluorescencia del carbazol por alcaloides tropánicos en ciclohexano ha sido estudiada en estado estacionario. Los resultados obtenidos indican la formación de un complejo por enlace de hidrógeno tanto en el estado fundamental como en el excitado. Los valores de las constantes de equilibrio son Kg = 18.0 M·I Y 158 < Ke < 430 M-I para el estado fundamental y el excitado res­pectivamente. SUMMARY The fluorescence quenching of carbazole by tropanic alkaloids in ciclohexane has been studied in the steady-state. The results obtained supports hydrogen-bond formation both in the ground and excited states. The values of the equilibrium constants are Kg 18.0  M-I Y 158 < Ke < 430 M-I both for the ground and excited states respectively. INTRODUCCION La desactivación de la fluorescencia de sondas luminiscentes ha sido muy empleada en la investigación estructural y dinámica de membranas naturales y sintéticas (1-5). En base al interés que posee el conocimiento de la dinámica de un grupo de alcaloides tropánicos en su paso a través de membranas, hemos abordado el estudio de la amortiguación de fluorescencia de lumóforos por mencionados Ars Pharmaceulica. Tomo XXXI. Núm. 3-4, 1990. 143 - 149. 144 ARS PHAR"MACEUTICA alc, aloides, en medios homogéneos, con objeto de establecer las condiciones de interacción idóneas para el posterior estudio en medios microheterogéneos. Después de múltiples ensayos preliminares, hemos encontrado que el carbazol es uno de los fluoróforos más sensible a la amortiguación por tropánicos. La fluorescencia del carbazol y sus derivados está recibiendo en la actualidad una gran atención, probablemente debido a su relación estructural con el triptófano. Según los últimos estudios realizados, la amortiguación de la fluorescencia del carbazol es debida principalmente a la formación de un complejo por enlace de hidrógeno (6-10) como resultado de la presencia de un átomo de nitrógeno con deficiencia electrónica (11); aunque se ha comprobado que también contribuye a la desactivación una interacción de transferencia de carga en el estado excitado (8) ( lO). MATERIAL Y METODOS Carbazol y N-eti1carbazol (99% Aldrich) fueron recristalizados dos veces en etanol absoluto, secados y sublimados antes de usarlos. Endo-8-metil-8-azabici­clo[3.2. 1] octan-3-ol (Tropanol) y a-(hidroximetil) ácido bencenoacético 8-metil-8-azabiciclo[3.2.1.] oct-3-il ester (Atropina) grado analítico fueron donados por Boehringer Ingelheim, recristalizados dos veces en n-heptano, y almacenados en desecador. Ciclohexano (CH), metanol y etanol (para espectroscopía de fluorescencia, Merck) fueron utilizados como disolventes sin posterior purificación. La pureza para la espectroscopía de absorción y emisión fue comprobada en todos los disolventes. Los espectros de absorción de las muestras fueron registrados en un Espectrofo­tómetro Lambda 5 de Perkin-Elmer. Las medidas de fluorescencia en estado esta­cionario se realizaron en un Espectrofluorímetro Shimadzu RF-5000 con un paso de banda de 15 Á Y 30 Á para excitación y emisión respectivamente. La longitud de onda de excitación fue la de un punto isosbéstico. Todos los espectros fueron corregidos para la respuesta del fotomultiplicador. En todos los casos, las muestras fueron desoxigenadas en la cubeta de fluores­cencia por paso de argón durante 4 minutos. RESULTADOS y DISCUSION En la fig. 1 se muestran los espectros de absorción del carbazol (2.5x 1O-5M) y del sistema carbazol 2.5x 10-5M -tropanol (0.5x 10-2 - 3.5x lO-2M) en ciclohexano. Como se puede observar aparecen varios puntos isosbésticos, así como una banda nueva a 337 nm que no es debida ni al carbazol ni al tropanol cuando se encuentran solos en disolución. En la figura 1 b se observa también que, en presencia de una concentra-ARS PHARMACEUTICA 145 ción alta de tropanol, el espectro de absorción se ensancha y desplaza hacia ell"ojo. Todos estos hechos han sido reconocidos como indicativos de un enlace de hidró­geno en sistemas tales como carbazol-piridina y dibenzocarbazol-piridina (7-10). 0.1 1 b O. "" u < "' 0.00 o: o 1 a "' < o.Óo 300 320 340 350 L0:"!GITUD DE ONDA (nm) Fig. l. a) Espectro de absorción de carbazol 2.5x 10·5M Y tropanol: (1) 0.0; (2) 0.2x 10.2; (3) OAx 10.2; (4) 0.8x l 0.2; (5) 1.0x 10.2; (6) 1.5x 10.2; (7) 2.0x l 0.2; (8) 2.5x l 0.2; (9) 3.0x l 0.2; (10) 3x5x 1O·2M. b) Efecto del enlace de hidrógeno en el espectro de absorción de carbazol en disolución de ciclohexano: (-) carbazol 2.5x 10·5M; (- - -) carbazol 2.5x 10·5M y tropanol 3.5x 10·2M. De otra parte, se obtiene una desactivación apreciable de la fluorescencia del carbazol cuando se aumenta la concentración de tropanol hasta 2. 5x 1 o-2M, como se aprecia en la figura 2, en la que además se puede observar la presencia de un punto isoemisivo, lo que es indicativo de que hay dos especies involucradas en la emisión fluorescente. Estos resultados junto a la ausencia de modificaciones en los espectros de absorción y emisión del carbazol inducidos por tropanol o atropina en disolventes hidroxilados, así como la ineficacia de los alcaloides mencionados para amortiguar la fluorescencia del N-etilcarbazol en ciclohexano, indican con claridad la fonna­ción de un complejo por enlace de hidrógeno tanto en el estado fundamental como en el excitado (7)(12)(13). 146 ARS PHARMACEUTICA ... , . ':::1 ::1 · , L.I .... .-.::� .. .. I ... J . I '::1::· 350. 320 500 LONGITUD DE ONpA (nm) Fig. 2. Cambio en la fluorescencia del carbazol en ciclohexano, con la adición de tropano!. Las concentraciones son: carbazol 2.Sx IQ"M; tropanol: (1) 0.0; (2) O.Sx I O"; (3) 1.0x lO", (4) I.Sx 10"; (5) 2.Sx 10·'M. De los cambios espectrales observados cuando se aumenta la concentración de tropanol, hemos determinado la constante Kg del equilibrio en el estado fundamen­tal (ver esquema 1), usando la ecuación 1 aplicada a la banda de absorción de 337 nm. El resultado obtenido, Kg = 18.0M·', es del mismo orden de magnitud que los aportados para otros enlaces de hidrógeno (7). l-djd [Q] _Kg+ __ E_C_H. .. _Q_( _�X_) __ Kg( ddoJ ECH(�) ) [1  ] En donde do y d son las absorciones a 337 nm de la disolución de carbazol y las de carbazol-tropanol, respectivamente, ECH y ECH ... Q son los coeficientes de extinción molar del carbazol y del complejo y [Q] es la concentración de tropanol en la disolución. Se puede calcular el valor de la constante Ke del equilibrio en el estado excitado (ver esquema 1), a partir del obtenido para Kg, y usando la ecuación 2: ARS PHARMACEUTICA 0,625 log K = log K ++---ou e g T 147 [2] donde T es la temperatura en la escala Kelvin y ou representa el desplazamiento espectral, que ha sido detenninado por la diferencia entre la posición del máximo de absorción expresado en número de onda (cm-I), o como la semisuma de las fre­cuencias de los picos de absorción y fluorescencia (también en cm-I)_ Los resulta­dos encontrados por ambos métodos han sido de 158 M-I Y 430 M-I respectivamente_ Aunque hay una cierta discrepancia entre los dos valores dependiendo del procedi­miento usado en el cálculo de ou , se puede aceptar en todos los casos que Ke » Kg, circunstancia que ha sido observada en otros sistemas relativamente similares (7) y que es de importancia en la explicación de la desactivación de fluorescencia por enlace de hidrógeno_ El aumento de la concentración de tropanol hasta 45xlO-2M, hace desaparecer el punto isoemisivo en los espectros de fluorescencia, como se indica en la figura 3_ Tal hecho se puede interpretar como resultado de la aparición de una tercera especie (emisiva o no) en equilibrio con las dos anteriores; aunque también podría ser el resultado de la alteración de la polaridad del medio con el aumento de la concentración de tropanoL � § ::! I 350,00 �-0,00 -JoID::::t===:¡= ..... ==.c..J...-'-t 320 400 500 LONGITUD DE ONDA. (nlll) Fig. 3. Desaparición del punto isoemisivo en los espectros de fluorescencia del sistema carbazol­tropanol. Las concentraciones son: carbazol 2.Sx I 0·5M; tropanol: ( 1) 0.0; (2) O.Sx lO"; (3) l .OxIO'; (4) l .SxIO"; (S) 2.Sx I 0"; (6) 3.SxI0"; (7) 4.SxI0"M. 148 ARS PHARMACEUTICA A la luz de los estudios de fotolisis con técnicas laser de picosegundos, efectua­dos por Mataga y Martín en sistemas dibenzocarbazol-piridina (8-10) se ha podido postular la existencia de un complejo de transferencia de carga no radiativo, en equilibrio con el complejo por enlace de hidrógeno en el estado excitado. Dada la similitud de tales sistemas con los que nosotros hemos investigado, así como el pequeño orden de magnitud del cambio en la polaridad del medio, cuando la concentración de alcaloide solo alcanza hasta 4.5xlO-2M (máxima solubilidad a 20ºC), se puede postular el siguiente esquema del mecanismo de los procesos de excita­ción y desactivación del sistema carbazol-alcaloide tropánico en disolución de ciclohexano: Esquema 1 Q/ K g CH + 7CH Q 1 hu, 1 hu a Q/ K e CH' + 7 (T -fr� (C'-H . . .  Q ) !l hu¡ CH (CH - Q) Una vez justificado el anterior mecanismo, se puede concluir que el carbazol es un lumóforo útil para el estudio de la amortiguación de su fluorescencia inducida por alcaloides tropánicos en medios apolares similares a los del interior de la bicapa lipídica de vesículas y membranas naturales. BmLIOGRAFIA (1) BADLEY, R.A. In Modem fluorescence spectroscopy; WEHRY, E.L., Ed.; Plenum Press: New York,; pp. 91-168, (1976). (2) BLATI, E. Y SAWYER, W.H. Biochim-Biophys. 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Amortiguación de la fluorescencia del carbazol por alcaloides tropánicos (I)

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