We have estudied the bistology and histocbemistry of A. cherimolia Mill. seed. In order to determine tbe most suitable conditions to extract, by means of solvents, substances Dragendorff positive and Sudan III positive, tbe appropiate histologic techniques were studied and tben applied.Hemos estudiado la histología e histoquímica de la semilla de A. cherimolia Mill. y se han puesto a punto y aplicado las técnicas histológicas adecuadas para determinar las condiciones idóneas de una posible extracción mediante disolventes, de principios que dan positivas las reacciones babituales de alcaloides y materias grasas

Barbera, J. M.

Cabo, J.

Villar, A.

Ars Pharmaceutica (Internet)

Spanish

Portal de revistas de la Universidad de Granada

ESTUDIO HISTOLOGICO, HISTOQUIMICO y MICROEXTRAC­TIVO DE SUSTANCIAS ALCALOIDICAS y GRASAS DE LA SEMILLA DE ANNONA CHERIMOLIA MILL VILLAR, A.*; CABO, J.**; BARBERA, J. M.* RES U MEN Hemos estudiado la histología e histo química de la semilla de A. cherimolia MilI. y se han puesto a punto y aplicado las técnicas histológicas adecuadas para determinar las condiciones idóneas de una posible extracción mediante disolventes, de principios que dan positivas las reacciones babituales de alcaloides y materias grasas. ABSTRACT We have estudied the bistology and histocbemistry of A. cherimolia MilI. seed. In order to determine tbe most suitable conditions to extract, by means of solvents, substances Dragendorff positive and Sudan III positive, tbe appropiate histologic techniques were studied and tben applied. RESUME Nous avons étudié l'bistologie et l'histocbimie de la graine de A. cherimolia MilI. On a développé et appliqué les téchni ques bistologi ques convenables pour préciser les meilleures conditions pour la possible extraction par des dissolvants, des principes donnant positives les réactions habituelles des alcalo·ides et des ma­tiéres graisses. * Departamento de Farmacognosia y Farmacodinamia de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Valencia. ** Departamento de Farmacognosia y Farmacodinamia de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Granada. Ars Pharmaceutica. Tomo XXIV. Núm. 3, 1983 244 ARS PHARMACEUTICA INTRODUCCION A. cherimolia MilI. es una Annonácea aclimatada y cultivada en las costas andaluzas de Málaga y sobre todo Granada. Popular­mente se han aplicado macerados y cocimientos hidroalcohólicos de la semilla para combatir parásitos del cuerpo humano (Pediculus capitis). Los agricultores que cultivan el chirimoyo en estas zonas, han observado que en un determinado radio no se desarrollan ne­matodos, hecho que no ha sido cOllstatado experimenta1me�te. Las Annonáceas contienen numerosos alcaloides (11) de los que se han efectuado, tanto de extractos globales como de alcaloides aislados, estudios dirigidos sobre todo a determinar el poder insec­ticida (9) y el poder citotóxico (5) (10) (12) (1 6). También se han efectuado estudios para determinar el poder insecticida de las frac­ciones oleosas (1) (4). MATERIAL y METODOS Las muestras utilizadas fueron recolectadas en el llamado «Valle del chirimoyo» (Granada) circundado por las poblaciones de Jete, Otívar, !trabo y Almuñécar, donde las condiciones climá­ticas y orográficas son las más parecidas a las tropicales. Se ha tra­bajado con material fresco, recientemente recolectado, entre los meses de Noviembre y Diciembre. Nos hemos valido de tres tipos de microtomo: el manual, el criostato o microtomo de congelación, de la casa Byrygh Criostats modelo Freestanding, y el microtomo Erma con platina congeladora electrónica Komaysu. Para la observación de los cortes, se ha empleado un micros­copio binocular PZO serie ML-5 con un sistema fotográfico Nikkon. También se ha utilizado un fotomicroscopio Zeiss modelo III, que nos ha permitido realizar estudios con luz ultravioleta. Hemos empleado dos grupos de reactivos. En un primer grupo incluímos aquellos que nos permiten observar y dilucidar estruc­turas, clasificándolos en: Ac/arantes (3): Agua, glicerina, soluciones al 20% de sosa, potasa e hipoclorito sódico y mezcla aclaran te (glicerina, hidrato de cloral y agua en proporción 5:3:3). ARS PHARMACEUTICA 245 De tinción de membrana: Schweizer (3), cloroyoduro de zinc (6), rojo congo, floroglucina clorhídrica, sulfato de anilina y sudán lII. Múltiples: Steinmetz (14), Tucakov, verde de yodo acético y rojo congo (8) y hematoxilina verde de yodo acético (2). En el segundo grupo incluímos aquellos que nos permiten localizar los diversos principios, posibles responsables de las accio­nes farmacológicas, clasificándolos en: Reactivos de grasas y esencias (14): Alcohol de 96° y Sudán 111. ¡?eactivos de sustancias alcaloídicas (14): Dragendorff, Bou­chardat y técnica diferencial de Errera (15). Reactivos de taninos y otras sustancias polifenólicas (14): Clo­ruro férrico, vainillina clorhídrica y dicromato potásico. Se ha centrado nuestra atención en la extracción de sustancias que dan positivas las reacciones habituales de alcaloides y grasas, a través de técnicas histológicas, por ser principios perfectamente identificados y localizados en el presente trabajo, y porque nos puede servir de base experimental para la extracción de principios en esta semilla. Para ello, preparamos tres medios diferentes: uno de agua neutra, otro de agua ácida (H2S04 IN) y un tercer medio con NaOH IN (Fig. 1). La técnica utilizada por nosotros, consiste en mantener los cortes histológicos en estos medios durante dos horas, haciendo un cambio del medio al finalizar la primera hora. Observamos los cor­tes de cada medio para ver las diferencias que pudieran experimentar los principios y, lavados, se preparan tres lotes de vasos en los que se colocan diferentes reactivos orgánicos (éter de petróleo, éter sul­fúrico, alcohol de 96°, alcohol tartárico al 1%, acetato de etilo, clo­roformo y benceno). Se mantienen los cortes en cada reactivo una hora, hacemos un cambio del mismo y los mantenemos otra hora. Tras teñir, cinco minutos en pocillo, se lavan y se observan (ver Fig. 1). RESULTADOS y DISCUSION I. Histología e Histoquímica La semilla presenta un epispermo totalmente lignificado (Fig. 2), muy duro, con una capa envolvente formada por grandes células desprovistas de contenido celular y gruesas paredes ligni-246 ARS PHARMACEUTlCA ficadas (e), y fibras en las tres direcciones del espacio (f1, f2 Y f3) alar­gadas y en forma de hueso, de manera que vistas en corte oblícuo (Fot. 1) dan la impresión de que se tratan de células pétreas, en corte perpendicular (Fot. 2) aparecen con una gruesa membrana y en corte longitudinal (Fot. 3) observamos que son alargadas y en forma de huso. Cortes . Histológicos Medio Medio Medio neutro ácido alcalino teñir teñir teñir y observar y observar y observar pasar a pasar a pasar a disolventes disolventes disolventes teñir teñir teñir y observar y observar y observar Fig. 1. -Es quema de la EXTRACCION DE PRINCIPIOS. -Los cortes histológicos se mantienen dos horas en cada medio con cambio del medio al finalizar la primera hora. Se lavan y se pasan a los reactivos disolventes (tomando muestras que se tiñen y observan) donde se mantienen otras dos horas con cambio del reactivo al finalizar la primera hora. Finalmente teñir y observar. e Fig. 2.-EPIS PERMO. C élulas envolventes (e), fibras oblicuas (f,), fibras perpen­pendiculares (ti) y ffibras longitudinales (f3) FOTOGRAFIA N° 1 Epispermo: corte oblícuo. Espesor: 24)1. Aumentos: 40 x 12,5 FOTOGRAFIA N.o 2 Epispermo: corte perpendicular. Espesor: 24}/. Aumentos: 40 x 12,5 FOTOGRAFIA N° 3 Epispermo: corte longitudinal. Espesor: 24}1. Aumentos: 40 x 12,5 ARS PHARMACEUTICA 249 El albúmen ruminado (Fig. 3) es celulósic;:o, sin ningún ele­mento lignificado, lo que diferencia las especies de las Annonáceas de las Magnoliáceas, muy cercana a ella (7) (13). Está formado por una cutícula envolvente (cu) y células paranquimatosas de contor­no irregular más o menos poligonales (c). ��(/y'M-----CU Fig. 3.-ALBU MEN. Cutícula (cu) y células parenqimatosas (c) La observación de cortes del albúmen directamente al micros­copio con luz ultravioleta, sin tinción ni tratamiento alguno, nos pone de manifiesto fluorescencia amarillo-blanquec.ina en la cutícula y espacios intercelulares, y grandes, manchas amarillas fluorescentes dispersadas por el parénquima, pero más acentuadas en la periferia (Fot. 4). Estas sustancias fluorescentes dan positivas las reacciones habituales de alcaloides, Dragendorff, Bouchardat (Fot. 5) y dife­rencial de Errera. FOTOGRAFIA N.o 4 Albúmen: observación al ult ravioleta. Espesor: 12. Aumentos: 10 x 10 FOTOGRAFIA N.o 5 Albúmen: tinción con Bouchardat. Espesor: 12. Aumentos: 10 x 10 ARS PHARMACEUTlCA 251 Con el Sudán 111 aparecen gran cantidad de gotículas anaran­jadas por todo el corte del albúmen (Fot. 6). Estas gotículas, al so­meter el corte a la acción del alcohol o del calor, y porterior tinción con el sudán 111, no desaparecen, por lo que se tratan de grasas. FOTOGRAFIA N.O 6 Albúmen: tinción con sudán III. Espesor: 12. Aumentos: 10 x 10 JI. Extracción de sustancias que dan positivas las reacciones habi­tuales de alcaloides y grasas A. Se han establecido las bases idóneas de una posible ex­tracción mediante disolventes, de principios que dan positivas las reacciones habituales de alcaloides, obteniéndose los siguientes resultados que esquematizamos en la Tabla 1. 1. o Tras mantener los cortes durante dos horas en medio acuoso neutro, lo sometemos dos horas a la acción de los diversos reactivos disolventes, lavamos con agua y observamos al microscopio las po­sibles alteraciones. 252 ARS PHARMACEUTICA El corte teñido y observado sin la acción de reactivos disol­ventes, aparece con precipitados especialmente en periferia. En los cortes mantenidos dos horas a la acción del éter sul­fúrico, desaparecen totalmente los precipitados, mientras que los sometidos a la acción del éter de petróleo siguen conteniéndolos. Tanto los sometidos a la acción del alcohol de 96° como los sometidos a la acción del alcohol tartárico al I %, no presentan apre­ciable variación en el contenido. Los cortes sometidos a la acción del acetato de etilo y los so­metidos a la acción del benceno, presentan pocos precipitados, lo que indica que son disueltos con lentitud. El cloroformo también disuelve los precipitados, quedando el corte muy clarificado. 2.° El corte mantenido dos horas en medio alcalino (NaOH IN), lavado y teñido sin someterlo a la acción de reactivos disolventes, a penas presenta precipitados. Tanto el éter sulfúrico como el éter de petróleo y el benceno, disuelven totalmente los principios. El alcohol de 96°, alcohol tartárico al I %, acetato de etilo y cloroformo, dejan alguna traza por periferia, sin lograr que desapa­rezcan los pocos precipitados observados en los cortes sometidos sólo a la acción del medio. 3.° El corte mantenido en medio ácido (H2S04 IN) y teñido sin acción alguna de reactivos disolventes, aparece con gran cantidad de precipitados, especialmente en la periferia, y con gran semejanza a los cortes mantenidos en medio neutro sin acción de reactivos disolventes. El éter sulfúrico y el cloroformo disuelven los precipitados, pero no totalmente, ya que quedan trazas principalmente en la pe­riferia. El éter de petróleo y el alcohol tartárico al I % no disuelven los precipitados, apareciendo por todo el corte, principalmente en periferia. El alcohol de 96° y el benceno disuelven totalmente los pre­cipitados, desapareciendo tanto de periferia como del resto del corte. B. Por el mismo protocolo establecido anteriormente, se ha determinado las condiciones idóneas para la extracción de materias grasas, llegándose a la::-- siguientes conclusiones (Tabla 2): 1.0 Tras mantener el corte histológico dos horas en medio acuo­so neutro, lo sometemos dos horas a la acción de diferentes reactivos disolventes, lavamos, teñimos durante cinco minutos en pocillo con ARS PHARMACEUTICA 253 TABLA 1. -Resultados de la extracción mediante reactivos disolventes de sustancias que dan positivas las reacciones habituales de alcaloides MEDIO Acuoso Eter sulfúrico Eter de petróleo AJcohol 96° . Alcohol tartárico 1 % Acetato etilo Benceno Cloroformo NEUTRO +++ + ++ +++ ALCALINO ++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ ACIDO ++ +++ + +++ ++ No disuelve (-); Disuelve poco (+); Disuelve pero quedan trazas (++); Disuelve totalmente (+++). sudán lIl, lavamos de nuevo con agua y observamos las distintas acciones de los reactivos disolventes en las diferentes condiciones de la experiencia. El corte teñido y observado sin la acción de reactivos disol­ventes, aparece totalmente cubierto de manchas redondeadas lipí­dicas, no solubles en alcohol, no volátiles al calor y de color ana­ranjado. Con el éter sulfúrico aparecen pequeñas gotas de grasa por el interior del corte y acúmulo en periferia. Con el alcohol de 96° y con la disolución alcohólica de ácido tartárico al 1% aparece el corte cubierto de pequeñas gotas de grasa y acúmulo en periferia. Los cortes sometidos al éter de petróleo presentan acúmulo en periferia, pero menos, y gotas pequeñas por todo el corte. Tanto con el acetato de etilo como con el benceno, sólo apa­rece tinción de grasas en una delgada franja acumulada en la peri­feria. Los sometidos a la acción del cloroformo, al igual que ocurría con los sometidos a la acción del acetato de etilo y el benceno, no presentan traza alguna de lípidos en su interior. 2 .° Los cortes sometidos al medio alcalino (NaOH IN), una vez lavados y teñidos con sudán IlI, sin la acción de reactivos disol-254 ARS PHARMACEUTlCA ventes, observamos que aparecen con menos lípidos que en el medio acuoso neutro, pero hay acúmulo de grasa en la periferia. Tanto el alcohol de 96° como el alcohol tartárico al l %, apare­cen pequeñas gotas por todo el corte y acúmulo de grasa en la peri­feria. Con el éter sulfúrico y el éter de petróleo, aparecen bastantes gotas de grasa por todo el corte y algo de acúmulo en periferia. Con el acetato de etilo a penas hay trazas en el corte y poco acúmulo en periferia. Tanto con el benceno como con el cloroformo, se acumulan las grasas en la periferia y además aparecen pequeñas gotas clorea­das por todo el corte. 3.° Los sometidos a medio ácido (H2S04 IN), una vez lavados y teñidos con sudán III, sin acción de reactivos disolventes, aparecen cubiert')s de gotas de grasas y con acúmulo en periferia: Con éter de petróleo y éter sulfúrico, aparecen las grasa acu­muladas en periferia y gotas sin a penas colorear por todo el corte. Igualmente ocurre con el alcohol de 96°. En el alcohol tartárico al 1 % aparece acúmulo en periferia y pequeñas gotas coloreadas por todo el corte. Lo mismo ocurre con el acetato de etilo. Tanto con el benceno como con el cloroformo, aparece colo­ración sólo en periferia, encontrándose el resto del corte limpio de grasas. TABLA 2. -Resultados de la extracción de materias de naturaleza grasa MEDIO Acuoso Eter sulfúrico Eter petróleo Alcohol 96° Alcohol tartárico 1% Acetato etilo Benceno Cloroformo NEUTRO + + ++ ++ ++ ALCALINO + ++ ++ + + ++ ++ ++ ACIDO ++ ++ + +++ +++ No disuelve (-); Disuelve poco (+); Disuelve pero quedan trazas (++); Disuelve totalmente (+++). ARS PHARMACEUTICA 255 Como RESUMEN-CONCLUSION podemos afirmar que: 1.0. -Se han establecido las bases idóneas de una posible ex­tracción mediante disolventes, de principios que dan po­sitivas las reacciones habituales de alcaloides, llegándose a las siguientes conclusiones: en medio neutro, los disolventes de elección son éter sulfúrico, cloroformo o mezcla de ambos. en medio alcalino, resultaron ser así mismo el éter sul­fúrico, éter de petróleo y benceno. en medio ácido, los disolventes más adecuados serían el alcohol de 96° y el benceno. 2.°. -Por el mismo protocolo establecido anteriormente, se ha determinado las bases idóneas para la extracción de ma­terias grasas que fueron, operar en medio ácido y realizar la extracción con benceno, cloroformo o mezcla de ambos. BIBLIOGRAFIA 1. BHOJRAJ, N.; BABU, M.; OSMANI, Z. M.; SALETORE, S. A. «Annona squamosa seed JI: The insecticidal fatty oil». J. Indian Chem. Soc., 16, 179, (1953). 2. BURCK, H. «Histologische Technik», Stutgart, Georg Tieme Verlag, pág. 106, 1966. 3. CABO, J.; PARDO, P.; FRAILE, A. «Prácticas de Farmacognosia y Farmacodinamia». 4.a ed., Granada, págs. 17-19, 1974. 4. CHEEMA, P. S.; DIXIT, D. S.; KOSHI, T.; PERTl, S. L. «Indigenous insecticides. II: Insecticidal properties of seed oil of Annona squamosa», J. Sci. In. Research., 17c, 132, ( 1958). 5. DURODOLA, J. I. «Antitumors effects against sarcoma 180 ascites of Annona senegalensis», Planta Med. , 28, 32, (1975). 6. PHARMACOPEE EURoPEENNE, Vol. I. Strausbourg, Maisouneuve, págs. 127-222, 1969. 7. HEYWOOD, V. «Flowering plants oi the world». Oxford, University Press, pág. 30, 1978. 8. HOTON, M. «Etude histochimique et chimique des feuilles de Lonchocarpus sericus», J. Pharm. Belg., 18, 10, (1963). 9. JACOBSON, M.; REDFERN, R. E.; MILLS, G. D. «Naturally occurring Insect Growt Regulators. II. Screening of insect and plant extracts as insect Juvenile Hor­mone Mimics», Lloydia, 38, 455, (1975). 256 ARS PHARMACEUTICA 10. KAYODE, E.; DURODOLA, J. 1. «Antituinor and antibiotic principies of Annona senegalensis», Phytochemistry, 15, l.311, (1976). 11. LEBOEUF, M.; STREITH, J.; CAVE, A. «Alcaloides des Annonácees: Alcaloides des écorces de Cananga odorata Hook. et Thomsom>, Ann. Franc., 33,43, (1975). 12. LLEANDER, G.; SANTOS, A.; SALUD, E.; RIGOR, E. «Tumor inhibitors. 1. Alka­loidal constituents of Uvaria rufa Blume», PhilijJine J. Sci., 98, 151, (1969). 13. ROQUES, H. «Précis de Botanique Pharmaceutique», Vol. 11, París, Libraire Mal­vine, pág. 245, 1959. 14. STAHL, E. «Analyse chromatographique et microscopique des drogues», Stuttgart, Enterprise moderne, pág. 231, 1970. 15. STTERNON, W. «Eléments de Chimie Végétale», 2.a ed., París, págs. 55 y 58, 1942. 16. WARTHEM, D.; GOODEN, E. L.; JACOBSON, M. «Tumor inhibitors: Liriodenine, a cytotoxic alkaloids from Annona glabra», J. Pharm. Sci., 58, 637, (1969). 

Estudio histológico, histoquímico y microextractivo de sustancias alcaloídicas y grasas de la semilla de Annona cherimolia Mill

Hemos estudiado la histología e histoquímica de la semilla de A. cherimolia Mill. y se han puesto a punto y aplicado las técnicas histológicas adecuadas para determinar las condiciones idóneas de una posible extracción mediante disolventes, de principios que dan positivas las reacciones babituales de alcaloides y materias grasas.We have estudied the bistology and histocbemistry of A. cherimolia MilI. 
seed. In order to determine tbe most suitable conditions to extract, by means of 
solvents, substances Dragendorff positive and Sudan III positive, tbe appropiate 
histologic techniques were studied and tben applied

Repositorio Institucional Universidad de Granada

https://digibug.ugr.es/bitstream/10481/82724/1/Ars%20Pharm.%201983%3b24%283%29_243-256.pdf

Estudio histológico, histoquímico y microextractivo de sustancias alcaloídicas y grasas de la semilla de Annona cherimolia Mill

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Portal de revistas de la Universidad de Granada

Repositorio Institucional Universidad de Granada