松本歯科大学大学院歯学独立研究科博士（歯学）学位申請論文;健康増進口腔科学講座（主指導教員:音琴　淳一教授

MATSUSHITA MAI

松下 雅衣

松本歯科大学大学院歯学独立研究科博士（歯学）学位申請論文;健康増進口腔科学講座（主指導教員:音琴　淳一教授）application/pdfothe

MATSUSHITA, MAI

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松下, 雅衣

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Matsumoto Dental University Repository

口群の比較をMann–Whitney U検定で行った．経管群と経口群のそれぞれについて口蓋・舌・咽頭の 3群間の比較を Friedman検定にて行った．サンプルごとのそれぞれの細菌叢の類似性は，主成分分析を行った．要因検索は，年齢，性別，寝たきり度，意識レベル，意思疎通， 9つの疾患，CPI，残存歯の有無，齲蝕，摂食状況（経管と経口）の18項目と細菌叢との関連性の検討は，第 1主成分分析の得点結果から相関比を求めた．要因検索は，項目間の関連性をχ2検定にて検討し，18項目間の相関行列を作成し，独立した項目かつ有意な相関比を要因として抽出した．経管群と経口群における口蓋の Shannon指数は，経管群3.3±0.8，経口群3.9±1.1であり，咽頭も経管群が有意に低かった．舌は，有意差を認めなかった．経管群と経口群における口蓋・舌・咽頭の Shannon指数の平均は，経管と経口で 3群間に有意な差を認めなかった．経管群と経口群における細菌構成率は，口蓋，舌，咽頭において，Neisseria属，Streptococcus属，Rothia属が全体の60～70％以上を占めていた．口蓋では，Neisseria属（29.8％）と Rothia属（16.6％）が，経管群で有意に多く，舌で，Neisseria属（28.9％），Streptococcus属（22.5 ％），Rothia属（21.3 ％）が経管群で有意に多く，咽頭で，Neisseria属（34.0％），Streptococcus属（24.3％），Rothia属（14.7％）が有意に多く検出された．主成分分析では，口蓋，舌，咽頭において細菌叢は明確な違いが認められ，口蓋・舌・咽頭における細菌叢と各項目との関連性は，口蓋，舌，咽頭ともに相関比が最も高く，相関行列から独立性が認められたものは，経管と経口のみであった．それぞれ，口蓋における経管と経口の相関比は0.423（P＜0.01），舌の相関比は経管と経口が0.517（P＜0.01），咽頭の相関比は経管と経口が（0.518：P＜0.01）となった．細菌の酸素要求性の比較は，口蓋で好気性菌の割合が経管群に有意に多く，舌で好気性菌と通性嫌気性菌の割合が経管群に有意に多かった．咽頭は，好気性菌と通性嫌気性菌の割合が，経管群で有意に多かった．本研究の結果から，経管栄養者の口蓋，舌，咽頭の細菌叢は共通しており，好気性菌の構成比率が有意に高く，Neisseria属，Streptococcus属，Rothia属が優占菌種であり，経管・経口が細菌叢を規定する独立した要因として認められた．松本歯学　47⑵　2021140book_松本歯学47-2_本文.indb   140 2022/01/27   8:41:00現在，歯科臨床において，顎骨腫瘍の摘出後の欠損を補う自家骨移植あるいは骨誘導再生法による顎骨の再生医療が行われている．これらの治療における臨床的課題として，移植骨の経時的な吸収や形成される再生骨量の不足が問題となっている．一方，骨組織における骨細胞の役割は永年不明であったが，近年，スクレロスチンというタンパク質を特異的に分泌していることが発見され，スクレロスチンには骨形成抑制作用があることが報告された．スクレロスチンは骨細胞から特異的に分泌されるタンパク質で，スクレロスチンの働きを阻害する抗スクレロスチン抗体は新規の骨粗鬆症治療薬として注目され，近年臨床応用されている．骨誘導因子（Bone morphogenetic protein : BMP）は，骨基質中に存在し，異所性骨形成を誘導するタンパク質である．BMP誘導性の異所性骨におけるスクレロスチンの発現については，未だ明らかにされていない．そこで，本研究では，リコンビナント BMP– 2 誘導性異所性骨におけるスクレロスチンの発現を観察し，その形成・吸収過程におけるスクレロスチンの役割を解析し，顎骨欠損に対する再生医療の研究に貢献することを目的とした．BMP–2を浸漬した直径 2mmの円柱のコラーゲンペレットを作製した．生後 7 週齢雄のC57BL/6マウスの右側大腿部内側の筋膜下にペレットを移植し，移植後 7日，10日，2週，4週，6週後に誘導されたペレットを採取した．採取した異所性骨をマイクロ CTおよび各種染色により組織学的解析を行った．BMP埋入後 7日で回収したペレットでは，マイクロ CTで解析可能な石灰化は認められなかった．組織学的解析では，移植した BMPペレットを取り囲むメタクロマジー陽性（トルイジンブ〔学位論文要旨〕松本歯学 47：141～142，2021BMP誘導性の異所性骨における骨形成抑制因子スクレロスチンの発現松下　雅衣松本歯科大学　大学院歯学独立研究科　硬組織疾患制御再建学講座（主指導教員：芳澤　享子　教授）松本歯科大学大学院歯学独立研究科博士（歯学）学位申請論文Analysis of expression of sclerostin, A bone formation inhibitor, in BMP–induced ectopic boneMAI MATSUSHITA Department of Hard Tissue Research, Graduate School of Oral Medicine, Matsumoto Dental University(Chief Academic Advisor : Professor Michiko Yoshizawa)The thesis submitted to the Graduate School of Oral Medicine,Matsumoto Dental University, for the degree Ph.D. (in Dentistry)book_松本歯学47-2_本文.indb   141 2022/01/27   8:41:00ルー染色）の軟骨組織を含む結合組織が認められた．また，アルカリホスファターゼ（Alkaline phosphatase : ALP）陽性の骨芽細胞も多数認められた．BMP埋入後10日で回収した異所性骨では，マイクロ CTにおいて，BMPペレット外周に石灰化像を認めた．組織学的解析では軟骨組織と骨組織を認めた．ALP陽性の骨芽細胞と共に，トルイジンブルー染色で認識される軟骨基質中に多数の軟骨細胞を認めた．抗スクレロスチン抗体を用いた免疫染色では，軟骨細胞においてスクレロスチンの発現を認め，骨様組織中にもスクレロスチン陽性骨細胞の出現を認めた．BMP埋入後2週間で回収した異所性骨では，マイクロ CTにおいて，BMPペレットを完全に取り囲む多孔質な石灰化像を認めた．組織学的解析では，埋入後10日で認められた軟骨様組織はほぼ消失し，骨様組織が占めていた．ALP染色では，骨芽細胞と軟骨細胞で陽性を示した．また，多孔質な石灰化組織に存在する骨細胞において，スクレロスチン発現が強く認められた．これらの骨細胞は，骨細胞の特異形質である象牙質マトリックスタンパク質–1（Dentin matrix protein–1 : DMP–1）と線維芽細胞成長因子–23（Fibroblast growth fac-tor–23 : FGF–23）のタンパク質発現が認められた．BMP埋入後 4週間で回収した異所性骨では，マイクロ CTにおいて，石灰化物の不透過性が亢進するとともに，外殻の厚さは薄くなっていた．組織学的解析では，層板様構造の石灰化物が認められ，ALP染色では骨芽細胞で陽性を認めるが，埋入後 2週間よりも弱い発現であった．層板骨の骨組織は扁平となり，骨細胞におけるスクレロスチン，DMP–1および FGF–23の発現が認められた．BMP埋入後 6週間で回収した異所性骨では，マイクロ CTにおいて，埋入後 4週間と同様であった．組織学的解析でも埋入後 4週間と類似した層板様構造であった．ALP染色では骨芽細胞で陽性を認めるが，かなり弱い発現であった．骨細胞におけるスクレロスチン，DMP–1およびFGF–23の発現は BMP埋入後 6週間でも維持されていた．以上の結果より，BMP誘導性異所性骨において，骨細胞はスクレロスチンを発現していた．また，興味深いことに，BMP誘導性異所性骨における軟骨細胞において，スクレロスチンの発現が認められた．このことから，スクレロスチンを標的としたアプローチは，顎骨再生医療におけるBMP誘導性の異所性骨形成にも有用な骨形成促進作用を示す可能性を示唆している．松本歯学　47⑵　2021142book_松本歯学47-2_本文.indb   142 2022/01/27   8:41:01

BMP誘導性の異所性骨における骨形成抑制因子スクレロスチンの発現

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Analysis of expression of sclerostin,A bone formation inhibitor,in BMP–induced ectopic bone

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