The role of calprotectin in vascular calcification associated with chronic kidney disease

Abstract

Chez les patients atteints de maladie rénale chronique (MRC), la morbidité et la mortalité dues aux maladies cardiovasculaires augmentent avec le déclin de la fonction rénale. La calcification vasculaire, via une rigidité artérielle et une insuffisance cardiaque, est un facteur de risque majeur de mortalité chez les patients souffrants de MRC. Favorisée par le trouble du métabolisme minéral et osseux et l'inflammation systémique chez ces patients, la calcification vasculaire est un mécanisme complexe caractérisé par le dépôt anormal de cristaux de calcium et de phosphate dans la paroi vasculaire. Malgré les efforts de recherche intensifs de ces dernières années, les traitements disponibles ont un effet limité et demeurent insuffisants pour reverser la pathologie. Par conséquent, l'objectif de cette thèse était de découvrir de nouveaux acteurs moléculaires associés aux complications cardiovasculaires et à la calcification vasculaire dans la MRC afin de fournir de nouveaux agents thérapeutiques potentiels. À l'aide d'une analyse protéomique et d'une validation par ELISA, nous avons identifié que la calprotectine, une protéine circulante associée à l’inflammation, était associé de manière significative et indépendante à la survenue de complications cardiovasculaires et à la mortalité chez 112 patients MRC (stade 3 et 4) et 171 patients dialysés. Ensuite, dans une cohorte indépendante de 213 patients MRC (stade 5), nous avons démontré qu'une augmentation de la calprotectine sérique était associée à une calcification vasculaire accrue. Le rôle pro-inflammatoire de la calprotectine via l'activation des récepteurs TLR4 (Toll-like receptor 4) et RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-Products) a été rapporté dans plusieurs maladies inflammatoires, mais jamais dans la calcification vasculaire. Ainsi, nous avons mis en évidence qu’un traitement par la calprotectine exacerbait la calcification in vitro, en utilisant des cellules musculaires lisses vasculaires primaires humaines et ex vivo, en utilisant des anneaux aortiques de souris. A l’aide d’études mécanistiques, nous avons démontré une implication de RAGE et TLR4 dans cet effet. De manière intéressante, l'utilisation d'un inhibiteur spécifique de la calprotectine, le paquinimod, atténuait l'effet pro-calcifiant de la calprotectine in vitro. Enfin, le rôle protecteur du paquinimod sur la calcification vasculaire a été confirmé in vivo dans deux modèles de souris : le modèle de néphrectomie subtotale et chez des souris âgées ApoE-/-. En conclusion, cette thèse montre que (i) la calprotectine est associée au développement de complications cardiovasculaires, à la mortalité et à l'état de calcification chez les patients atteints de MRC, (ii) la calprotectine favorise la calcification vasculaire (iii) le paquinimod est un nouvel agent thérapeutique efficace sur la calcification vasculaire.In patients with chronic kidney disease (CKD), the risk of cardiovascular disease and mortality steadily increases as kidney function declines. Vascular calcification, leading to aortic stiffening and heart failure, is a decisive risk factor for cardiovascular mortality in patients with CKD. Promoted by bone mineral disorder and systemic inflammation in CKD patients, vascular calcification is a complex mechanism characterised by the abnormal deposition of calcium and phosphate salts in the vascular wall. Despite intensive research efforts in recent years, available treatments still have limited effect. Therefore, the aim of this thesis was to unravel new molecular changes associated to cardiovascular morbid-mortality in CKD and to decipher the role of novel candidates on vascular calcification to provide potential new therapeutic agents. Using serum proteomic analysis and further validation through ELISA, we identified that calprotectin, a circulating damage-associated molecular pattern, was significantly and independently associated with cardiovascular outcome and mortality in 112 CKD3-4 and 171 CKD5 patients on dialysis. Next, in an independent cohort of 213 CKD5 patients, we demonstrated that higher serum calprotectin was associated with increased vascular calcification. The pro-inflammatory role of calprotectin through activation of TLR4 (Toll-like receptor 4) and RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-Products), has been reported in several inflammatory disorders, but never in vascular calcification. For this reason, we next evaluated the role of calprotectin in vitro, using human primary vascular smooth muscle cells and ex vivo, using mouse aortic rings. Calprotectin exacerbated calcification in both approaches increasing calcium content and alkaline phosphatase activity. Furthermore, mechanistic studies demonstrated an involvement of RAGE and TLR4 on this effect. Interestingly, the use of a specific inhibitor of calprotectin, named paquinimod, attenuated the pro-calcifying effect of calprotectin in vitro and ex vivo. The protective role of paquinimod on vascular calcification was further demonstrated in two mice models: 5/6 subtotal nephrectomy mice model and in old ApoE-/- mice. To conclude, this thesis shows that (i) calprotectin is associated with cardiovascular outcome, mortality and calcification status in CKD patients, (ii) calprotectin promotes vascular calcification (iii) paquinimod is an effective novel therapeutic agent on vascular calcification