Functional interactions of megakaryocytes with the extracellular matrix

Abstract

La maturation du mégacaryocyte (MK) dans la moelle osseuse mène à l'élongation et la traversée des proplaquettes à travers les sinusoïdes, pour former les plaquettes sanguines. Ce processus complexe est régulé par l'interaction avec le microenvironnement, la matrice extracellulaire (MEC) et les cytokines comme la thrombopoïétine et le Stroma-Derived Facteur -1. Le contact avec la MEC se fait grâce à des structures particulières retrouvées dans de nombreuses cellules : les podosomes. Leur altération conduit à des thrombopénies comme dans le cas des patients atteints du syndrome de Wiskott-Aldrich, où la protéine WASp, majeure pour les podosomes, est mutée. Ces structures punctiformes sont caractérisées par un cœur riche en F-actine et des protéines régulatrices (Cortactine, WASp, GTPases, Tks...), entouré d'un anneau contenant des récepteurs de contact avec la MEC (intégrines par exemple) et des protéines mécanosensitives comme la Vinculine, Taline, Paxilline et la Myosine. Ces protéines sont aussi retrouvées dans les filaments d'actine latéraux qui permettent l'interconnexion de podosomes adjacents. Nous avons montré que le MK forme différentes structures d'actine dépendant du type de matrice avec lequel il est en contact : des podosomes punctiformes sur du fibrinogène, de la fibronectine ou du collagène de type I, et des podosomes linéaires exclusivement au contact du collagène fibrillaire. Par microscopie de super résolution, nous avons décrit l'ultrastructure de ces podosomes et leur composition protéique qui est similaire de celle des punctiformes. L'étude de leur dynamique a montré que les podosomes linéaires venaient essentiellement de la fusion de podosomes punctiformes, bien que la nucléation de novo intervienne aussi. En sa qualité de régulateur central de la dynamique podosomale, nous montrons que la Myosine IIA est indispensable à cette restructuration. Les invadosomes linéaires ont été décrits dans d'autres types cellulaires comme étant des sites privilégiés de digestion de la MEC. De façon surprenante, nous avons observons une forte diminution de la capacité de dégradation de la matrice ainsi que de l'expression de Tks5, protéine centrale de ce processus, au cours de la mégacaryopoïèse, alors que les podosomes linéaires non digestifs, sont de plus en plus nombreux. Ainsi, les podosomes linéaires du MK diffèrent des invadosomes linéaires des autres cellules car ils n'expriment pas Tks5/4. Ce changement de composition se traduit par un changement de fonction puisque nous observons qu'ils développent un potentiel de transmission de forces contractiles résultant en la traction des fibres de collagène à partir d'une matrice relâchée. Si le collagène est rendu immobile par fixation des fibres entre-elles par le glutaraldéhyde, nous constatons que le MK, dont le corps cellulaire est alors la composante la plus malléable, va étendre des protrusions le long des fibres, laissant supposer que ces dernières pourraient en fait servir de guide pour la libération des proplaquettes vers les vaisseaux médullaires. De façon intéressante, nous avons identifié que GPVI intervenait comme récepteur du collagène I pour la formation des podosomes linéaires. Des premiers résultats sur la signalisation impliquée montrent que la kinase Syk et la Calmoduline, connue comme activateur de Myosin Light Chain Kinase qui va phosphoryler la Myosin Light Chain, et donc réguler la fonction de l'actomyosine, interviennent en aval de GPVI.[...]Megakaryocyte (MK) maturation within the bone marrow leads to the production of proplatelets that will cross the endothelial barrier to form platelets within the bloodstream. Interactions with microenvironment, extracellular matrix (ECM) and cytokines such as Thrombopietin or Stroma-Derived Factor-1 are required for differentiation to happen. Contacts with the ECM utilizes specialized structures found in various cell types and called podosomes. Their dysregulation leads to thrombocytopenia as found in the Wiskott-Aldrich syndrome, characterized by a loss of podosomes upon mutation of the WASp protein. Those dot-like structures encompass a core formed by F-actin and regulatory proteins (Cortactin, WASp, GTPases, Tks...), surrounded by a ring containing matrix receptors (e. g. integrines), and mechanosensitive proteins such as Vinculine, Talin, Paxillin, and Myosin. These proteins are also found in lateral actin filaments that interconnect podosomes, thereby allowing co-function of neighbors podosomes. Herein, we demonstrated that MKs formed different actin structures depending on the matrix they interact with: classical dot podosomes on Fibrinogen, fibronectin and type I collagen. However, the later also induced linear podosomes formation in mature MKs. Using Structured Illuminated Microscopy, we elucidated the structure and composition of both types of podosomes and found it to be fairly similar. Videomicroscopy demonstrated that linear podosomes are mainly formed by fusion of dot podosomes, nucleation from extremities of a preexisting small linear podosome being also observed. Linear invadosomes were described in other cells as preferential structures for matrix degradation. Surprisingly, we observed a strong decrease in matrix digestion activity, together with a decrease in the expression of Tks5, a hallmark of degradative abilities during the megakaryopoiesis, while non-digestive linear podosomes accumulated. Indeed, MKs linear podosomes differ from others because they do not express Tks5/4 anymore. Moreover, we demonstrated that Myosin IIA is necessary for linear podosome formation. This switch in composition leads to a change in function because we observed the development of potent force transduction capabilities resulting in traction of loose collagen fibers under MKs. Interestingly, we showed that GPVI acted as collagen I receptor in the formation of linear podosomes. Preliminary data regarding signaling showed that the Syk kinase and Calmodulin, known as an activator of the Myosin Light Chain Kinase which phosphorylates Myosin Light Chain and thereby regulated actomyosin function, acted downstream of GPVI. Taken together, these data support the model in which hematopoietic progenitors migrate through the bone marrow using podosomes digestive activity and lose this function while maturing. However, sinusoids proximity also required mechanosensitive ability of podosomes. Indeed, we published in a collaborative work that podosome-like structures are found at the extremities of mature MKs protrusions to start trans-endothelial crossing to reach the blood flow. To conclude, this work shows for the first time a change in composition, structure and function of podosomes during MK maturation. Thereby, it highlights a new vision of the adaptability of podosomes under physiological conditions, to accommodate the uprising of new specific cellular functions such as platelet production