NKG2D and DNAM-1 immunosurveillance mechanisms in hepatocellular carcinoma

Abstract

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la 4ème cause de mortalité par cancer dans le monde sans traitement efficace. Deux principales tumeurs se distinguent : 1) agressives de mauvais pronostic, proliférantes, inflammatoires fréquemment mutées dans le gène TP53, 2) de meilleur pronostic bien différenciées, stable dans leur génome, peu inflammatoires et associées à des mutations activatrices dans le gène CTNNB1 codant la beta-caténine. De nombreux travaux ayant montré le rôle essentiel du microenvironnement immunitaire dans le cancer, l'immunothérapie représente une perspective très intéressante pour le traitement du CHC. Dans ce contexte, mes travaux de thèse visent à étudier les mécanismes d'immunosurveillance appelés NKG2D et DNAM-1 dont le rôle n'a pas encore été clairement établi dans le CHC. Ces systèmes sont basés sur la reconnaissance de ligands (NKG2DL et DNAM-1L) exprimés lors d'un stress oncogénique à la surface des cellules tumorales et qui sont reconnus par le récepteur spécifique (NKG2D et DNAM-1) sur les cellules immunitaires permettant leur activation et la lyse des cellules tumorales. Tout d'abord, nous avons analysé l'expression des ligands de NKG2D (MICA/B et ULBP1/2) dans une cohorte de patients atteints de CHC et dans nos modèles murins récapitulant les deux types de tumorigenèse humaine. De façon intéressante, nous montrons que l'expression des ligands de NKG2D est associée aux CHC de mauvais pronostic. Plusieurs études ont d'ailleurs montré que ce mécanisme était associé à une inflammation du tissu hépatique (hépatite) et à une tumorigenèse aggravée chez la souris. De façon intéressante, nous avons observé que l'expression des ligands ULBP1/2 est drastiquement diminuée dans les CHC mutés pour la beta-caténine (non inflammatoire) et corrèle négativement avec les cibles de la signalisation beta-caténine. Nous avons analysé plus précisément ces résultats dans nos modèles murins et démontrons que l'expression des ligands de NKG2D, Rae-1, orthologues des ULBP1/2 chez l'Homme, sont directement inhibés par la signalisation beta-caténine. Ainsi, nous démontrons que les ligands de NKG2D sont associés à une tumorigenèse aggravée et inflammatoire et que l'inhibition d'une partie de ces ligands par la signalisation beta-caténine expliquerait le phénotype non inflammatoire des tumeurs CTNNB1 mutées. Pour le système DNAM-1, nous montrons que l'expression des ligands CD155 et CD112 est augmentée dans le CHC, sans distinction entre les différents types de CHC. L'analyse de l'expression du récepteur DNAM-1 à la surface des cellules immunitaires à fort potentiel anti-tumoral (NK, NKT et lymphocytes T CD8+) a permis de montrer que ces populations expriment différemment le récepteur DNAM-1 en terme de proportion et de quantité relative (MFI) et que seules les cellules NKT exprimaient toutes le récepteur DNAM-1 (100%) dans un foie normal. De façon intéressante, cette proportion est diminuée spécifiquement dans les CHC mutés pour la beta-caténine laissant alors apparaitre une population de NKT DNAM-1 négatives. L'analyse fonctionnelle par cytométrie en flux et RNAseq de des populations de NKT DNAM-1 positives et négatives extraites des tumeurs démontre que les NKT DNAM-1 négatives arborent un phénotype de cellules épuisées (diminution de leur production d'IFNg et de l'expression des molécules cytotoxiques granzyme B et perforine). Ces résultats montrent que la perte du récepteur DNAM-1 à la surface des cellules NKT signe la perte de leur capacité anti-tumoral. Mes travaux de thèse ont permis de démontrer le rôle délétère du mécanisme NKG2D dans la tumorigenèse hépatique et dévoilent la présence d'une population épuisée de NKT DNAM-1 négatives dans les CHC mutés pour la beta-caténine. L'ensemble de ces résultats montre que les mécanismes NKG2D et DNAM-1 sont moins sollicités dans les CHC mutés CTNNB1 ce qui expliquerait possiblement leur statut peu inflammatoire.Hepatocellular carcinoma (HCC) is the 4th leading cause of cancer-related worldwide without effective treatment. Two main types of tumors can be distinguished: 1) aggressive with poor prognosis, proliferative, inflammatory, harbouring chromosomal instability and frequently mutated in the TP53 gene 2) better prognosis, well differentiated, stable in their genome, low inflammatory status and associated with activating mutations in the CTNNB1 gene encoding for beta-catenin. As many studies have shown the essential role of the immune microenvironment in cancer, immunotherapy represents a very interesting perspective for the treatment of HCC. Interestingly, my thesis work aims to study immunosurveillance mechanisms called NKG2D and DNAM-1 whose role has not yet been clearly established in HCC. These systems are based on the recognition of ligands (NKG2DL and DNAM-1L) expressed after oncogenic stress at the surface of tumor cells and which are recognized by the specific receptor (NKG2D and DNAM-1) on immune cells allowing their activation. We have studied these mechanisms in hepatic tumorigenesis in both humans and mice. First, we analysed the expression of NKG2D ligands (MICA/B and ULBP1/2) in human and in our mouse models recapitulating the two types of human tumorigenesis. Several studies have shown that NKG2D ligands expression is associated with inflammation of liver tissue (hepatitis) and aggravated tumorigenesis in mice. In this context, we observed that the expression of ULBP1/2 ligands is drastically decreased in beta-catenin-mutated HCC (non-inflammatory) and negatively correlates with the targets of beta-catenin signalling. We analysed these results more precisely in our mouse models and demonstrate that the expression of NKG2D ligands, Rae-1, ULBP1/2 orthologous in human, was directly inhibited by beta-catenin signalling. Thus, we demonstrated that NKG2D ligands are associated with an aggravated and inflammatory tumorigenesis and that the inhibition of part of these ligands by beta-catenin signalling could explain the non-inflammatory phenotype of CTNNB1-mutated HCC. For the DNAM-1 system, we show that the expression of its ligands (CD155 and CD112) is increased in HCC, without distinction between the different type of HCCs. Analysis of DNAM-1 receptor expression on immune cells with high anti-tumor potential (NK, NKT and CD8+ T cells) showed that these populations express DNAM-1 receptor differently in terms of proportion and relative quantity (MFI) and that all NKT cells expressed the DNAM-1 receptor (100%) in a normal liver. Interestingly, this proportion is specifically reduced in beta-catenin mutated HCCs resulting in the presence of a DNAM-1 negative NKT population. Functional analysis by cytometry and RNAseq of DNAM-1 negative versus DNAM-1 positive populations extracted from tumors shows that DNAM-1 negative NKT exhibits an exhausted phenotype (decrease in their IFNg production and granzyme B, perforin cytotoxic molecules expression). These results convincely show that the loss of DNAM-1 receptor on NKT cells signifies the loss of their anti-tumor capacities. My thesis work evidenced the deleterious role of NKG2D mechanism in hepatic tumorigenesis and revealed the presence of an exhausted DNAM-1 negative NKT population in beta-catenin mutated HCC. Collectively, these results show that both NKG2D and DNAM-1 mechanisms are less solicited in beta-catenin-mutated HCC, confering possibly to the tumors their the low inflammatory status