Nopean ja kustannustehokkaan serologisen monianalyyttilateraalivirtausmäärityksen kehittäminen hinkuyskän diagnosointiin

Abstract

Hinkuyskä on maailmanlaajuinen Bordetella pertussis -bakteerin aiheuttama herkästi tarttuva hengitysteiden infektio. Hinkuyskän korkeasta rokotusasteesta huolimatta taudin esiintyvyys on lisääntynyt. Nykyisin taudin diagnosointiin käytettävät menetelmät ovat kalliita ja aikaa vieviä. Suurin osa sairastapauksista esiintyy kehitysmaissa, joissa tarvittavia resursseja on rajoitetusti, joten uusia helppokäyttöisiä diagnosointimenetelmiä on kehitettävä. Diplomityön tavoitteena oli kehittää hinkuyskän diagnosointiin lateraalivirtausmääritys, joka on kvantitatiivinen, helppokäyttöinen, nopea, kustannustehokas, ja antaa diagnostisesti eroteltavaa tietoa potilaasta. Diplomityössä optimoitiin aikaisemmin kehitettyä hinkuyskän serologiseen diagnosointiin tarkoitettua lateraalivirtausmääritystä nopeammaksi ja helpommaksi. Näytemateriaalina kokoveri on nopeampi ja helpompi vaihtoehto kuin seerumi potilasläheisessä diagnostiikassa. Diplomityössä kehitettyä kokoveripohjaista määritystä verrattiin seerumipohjaiseen standardoituun entsyymivälitteiseen immunosorbenttimääritykseen (engl. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) referenssimäärityksellä käyttäen rokotenäytteitä (kokoverinäytteet = 141 kpl). Diplomityössä tutkittiin myös proteiini A- ja L-konjugoitujen europium-nanopartikkelien toimivuutta kokonaisimmunoglobuliinipitoisuuden määrittämisessä seeruminäytteistä (18 kpl). Lisäksi kehitettiin monianalyyttimääritys, jossa käytettiin testiviivoilla kolmea bakteerin virulenssitekijää. Kokoverimäärityksen tulokset korreloivat ELISA:n tuloksien kanssa kohtalaisesti (Pearson r=0,632), mutta vaihtelua havaittiin huomattavasti. Kokoveritestin analyyttinen herkkyys osoittautui huonommaksi kuin ELISA:lla, mutta testin tarkoituksen huomioon ottaen riittäväksi. Kehitetty lateraalivirtausmääritys kokoverellä oli yksinkertaisempi, edullisempi ja nopeampi verrattuna perinteisiin menetelmiin. Proteiini L- leimakonjugaatti vaikutti lupaavalta näytteen kokonaisimmunoglobuliinipitoisuuden määrittämisessä. Monianalyyttimääritys osoitti hyvää spesifisyyttä ja tulokset olivat semikvantitatiivisia. Joidenkin näytteiden kanssa havaittiin kuitenkin epäspesifistä sitoutumista tietyillä antigeeni-testiviivoilla. Yhteenvetona voidaan todeta, että kehitetyt menetelmät vaikuttivat lupaavilta vaihtoehdoilta hinkuyskän serologiseen diagnosointiin, mutta menetelmien herkkyyden ja toistettavuuden parantamiseksi, lisää tutkimusta on suoritettava. Esimerkiksi käänteisviritteisten nanopartikkelien toimivuutta voitaisiin testata analyytin havaitsemisessa. Lisäksi monianalyyttimäärityksessä tulisi tutkia infektiospesifisien antigeenien toimivuutta.Whooping cough is a global infection caused by Bordetella pertussis -bacteria. Despite the high vaccination rate of pertussis, the incidence of the disease has increased. The methods currently used for pertussis diagnostics are expensive and time consuming. Most pertussis cases and deaths occur in developing countries, where the necessary resources are limited. New point-of-care diagnostic methods need to be developed. The aim of the thesis was to develop a lateral flow assay which is quantitative, easy to use, fast, cost-effective, and provides diagnostically differentiated information about the patient. In this study the whole blood based lateral flow assay was compared to serum-based standardized enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with whole blood samples (141 pcs) and investigated the functionality of protein A- and L-conjugated europium nanoparticles in determining the total immunoglobulin concentrations of the sample with serum samples (9 pcs). Multi-analyte assay was developed using three test lines with virulence factors of the Bordetella pertussis -bacteria. The results of the whole blood lateral flow assay correlated moderately with the results of the ELISA assay (Pearson r = 0.632), but significant variation was observed. The analytical sensitivity of the whole blood test proved to be inferior to with ELISA, but sufficient considering the cut-off levels. The developed whole blood based lateral flow assay is simpler, cheaper, and faster compared to traditional methods. The protein L-label conjugate appeared promising results in determining the total immunoglobulin content of the sample, but the best signal response was achieved with protein A-label conjugate. Good specificity was observed with developed multiplex lateral flow assay and the results were semiquantitative. However, non-specific binding was observed on with certain antigen test lines. In conclusion, the developed methods appear to be promising alternatives for the serological diagnosis of pertussis. To improve the sensitivity and reproducibility of the methods, further research is needed. For example, upconverting nanoparticles should be tested as a label and the functionality of infection-specific antigens should be studied in a multiplex lateral flow assay