取得学位：博士(理学)，学位授与番号：博甲第939号，学位授与年月日：平成19年3月31

Ogawa, Daisuke

小川 大輔

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小川大輔博士（理学）博甲第９３９号平成１９年３月３１曰課程博士(学位規則第４条第１項）シロイヌナズナ熱ショック転写因子HsfA2の機能解析山口和男（学際科学実験センター・教授）岩見雅史（自然科学研究科・教授)，星名哲（自然科学研究科・准教授)，西内巧（学際科学実験センター・准教授)，金森正明（自然科学研究科。講師）氏名学位の種類学位記番号学位授与の曰付学位授与の要件学位授与の題目論文審査委員（主査）論文審査委員（副査）Heatshocktranscriptionfblctm(HsfS)arethecentralreguIatorsoftheheatshock(HS)stress泥sponseinalleukaryoticorganisms､ＨＳ/S42isoneofthMmbiaOpsisclassAHﾂﾞｫﾘandtheinductionofH1f42expressioninresponsetoHSstressishighestamongthoseoMmbidbpJなZ1differentHn/3.HOwev則1ittleisknownHsfA2tmnscriptionaltargetgenesandfUnctionsinAmZMOp血InthisstudybwegeneratedHb[j942ove1℃xpressingtransgcnicA肋iとlopsiJplantsC5S::HSf42）ａｎｄdominant-pegativemutantsofHﾂﾞiA2(J5SJfHE/54Ｍａ解)The35S:fHff＃l2plantsexhibitedadwaIfphenotypeandremarkablebothbasalandacqui1℃dtheTmotolerance・Bycontmst，ｔｈｅ３殿fHq/:Ａ２△ａ解plantsdisplayedreducedboththelmotolerance,Wecarriedoutmicroarrayanalysisofthe弱SF:Ｈ１/,42plantsandidentifiedcandidategenesregulatedbyHsfA2,whichexhibitedHSstress-inducedexpressionasweIlasHE/'42.FUrthermore,wefbundthattheexpressionofHYﾉｼ４２wasalsoinducedbysaItandosmoticstlesMndthe新SF:Hﾛﾉｼl2p1antsalsoshowedtolerancetothesestress・Interestingly’３凧PH51942and35SfJHZfA24C2解plantsexhibibedenhancedanddecreasedcallusgrowth,respectively・TheseresultslevealthatHsfA２１℃gulatesavarietyofgenesrelatedtostressresponseandplaysanimportantroleinplantmultiples舵sstoleranceandsuggestthatHsfAZisaIsoinvoIvedindeveIopmentalplocess．自然界において植物は様々な環境ストレスに曝される。動物と違い移動することができない植物は、環境ストレスに対抗しその環境に適応しなければ生き延びることができない。そのため植物はこれらの環境の変化をいち早く感じとり、環境に適応する応答機構を進化の過程で獲得してきたものと考えられる。生物が高温ストレスに曝されるとタンパク質の損傷、変性による機能障害が起こる。そのため、生物はタンパク質の構造を維持し、変性タンパク質の凝集を妨げるために熱ショックタンパク質(HSP)と呼ばれる分子シャペロンを発現させる。真核生物ではＨ３ｐ遺伝子などの熱ショック(HS)ストレス応答性遺伝子の転写は、それらのプロモーター領域に存在するＨＳ応答性シスエレメント(HSE)を認識する熱ショック転写因子(HSf)によって制御される。シロイヌナズナゲノムには２１個のＨＶ遺伝子が存在する。その中でもＨＳ７５４２は最も著しいＨＳストレス応答`性が示されていることから、シロイヌナズナのＨＳストレス応答に重要な役割を果たすのではないかと考えられる。しかし、これまでHsfidL2タンパク質が植物体内でどのような機能を持つかは調べられていなかった。そこで本研究において、私はmy,４２の過剰発現植物体、ＴＤＮＡ挿入変異植物体、及びドミナントネガティブ変異植物体を作出または入手し、それらの解析を行うことでHSfA2の機能を明らかにすることを試みた。まず､HIV,４２の発現様式を明らかにするために､半定量的ＲＩＴＣＲ法によりＨＳストレス時のHVz42発現量の変化を検証した。そして、ＨＭ４２はＨＳストレスに対して急速な応答を示し、それは一過－１４－的なものであることを明らかにした。また、ｆｌＭ４２遺伝子上流にはＨＳＥの存在が認められたため、この領域とレポーター遺伝子GUS｢との融合遺伝子を作製し、植物内で発現させることにより、ＨＳストレスに応答したＧＵＳの発現が起こること､つまりＨＱ/,42プロモーターの転写活性はＨＳストレスに依存していることを明らかにした。次に、植物内での高発現プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルスJjHｱブＡＢ頚！…￣．、． ３５s砥》Hs鰯Ａ２：”！：闇！ｗＴ瀞,９鍾趣澪Ⅷ一ロモーター制御下でＨｓ/》４２を過剰発現するトランスジエニツク植物(3鮒'Ｈｖ/,４２>を作出し、その表現型の観察を行った。作出し韓黛診ば１月itた３狐:Ｈ＄〃植物は通常の生ﾔﾐｶﾞﾄﾞ条件下で麹#熊間鍾愛鰄鐘鞠(鐙…錘)蝿麹〈A)３５ｓX/総銃２蕊鞠におけるＨｓﾒﾂl』?;ii《量子艶蕊籔・ＭＳ塔麹で１０貫鎚叢露鳶せた野鑓騨籍い､鐇化を示した。リアルタイムＰＣＲおよび35s;祠s瀬21鋪がち属NA蓬…し…c輔A合威淡､ﾘｱﾙﾀｲﾑＰＣＲ解轤に承り雑fA2懲蕊ji1;驚鷺麹した鐵歎懲峰Ａ｡t鯰2.Sii蕊鬮鰯鑓対する繍対穰鑑示す執解析の結果から、この植物体の綾化は鱈)鰭翻後3週綴喜の野生麹隷よび3鐙:擬…纏鞠｡地上観のみ篭示藻ｽｹｰﾙﾊﾟｰ鰭ｌ１ＣＩＷＨＶ５４２発現量と相関があることがわかった（卿１Ａ,Ｂ)。Ｊ５ＳｊｆＨｓ/312植物の高温耐性試験を行しｗh:/,ｨ１２ｍＲＭの蓄積が繍臘耐`憐に聯える影響を調べた。その結果、３jx1MZW:42植物は野生型植物と比較して、高温耐性が馨しく向上していた（図２)．また、植物体に弱いＨＳストレスを与え耐'雛を獲得させる処理(馴化処理)後の高温耐`性（獲得性高温耐性）；こおいても、濁様の結果が得られた。これらの結果から、瓢sfA2が轤物の高臘耐`朧に蕊蕊な役霧Ｉを果たすこと菱明らかにすることができた．HsfA2は転写活`朧化lilil子であることが示唆されていたが、その標的選伝子は未知であった。そこでHsfA2標的遺伝子を明らかにするため、汀AWflUfJ2植物のマイクロアレイ解析を行った．その結繋、野生製植物に比べ発現f蕊がＺ傭以上に上昇している遺伝子・として243個の遺伝子･を得ることができた。その頃'.にはn町1,など多数のストレス応鱒鵬朧遺伝子をj;iL出すこ左ができた。これらの遺伝子の多くはその上流配列にＨＳＥの存在が認められ、マイクロアレイデータベースの検索からＨＳストレス挺応簿することが明らかとなった。また、この中の複数の遺伝子について発現解析を行い（鰯３)、それらの発現蝋が胸躯発現鍵に依存していること、11ｓストレスに対してＨｉγ242とよく似たパターンで応答することを鯛らかにした。Ｗ735銭f鞄鱗２露一面アブ重~Yi7rc〉'1忽鵬２好SpyZa/1.Ｃ’Ｈ５ｐｙａ7忽ノナI翻り”･プ御銅?OプＩｌ８ｉＥｌプトツ剣ＥＺａＧｏ庵サAPX2ELIP3lBF7官ＡごIUn蕊塾露Srlﾑｿﾞﾐ鰍ＩＡ２'縫鰯|鯵蕊濃籔幾鶴綴纏１０蔑蕊２Z℃で鏡露議懲錘騨畿翻および３５全鑓溌２雛繁雑対して、罰Ｓス拳レス鍵露《くる℃､：蕊灘》を篭穿鍾鶏巍総菖臼鱒２琴Ｃで麓驚喜越彪、園３HsfA2潔錘遜篭子の発現解舗鵜灘後１０国綴２２℃で』&鏑rさせた野生型および３５ａ:龍が辺鍾物に講してＨＳストレス《37℃、１鋳悶）遜璽を行い、RNA籟出後、半定籔鐵ＲＴＰＣＲ蕊により溌箭した。ＰＣ貧のサイクル数はＡＣ鋤以外は2鼻サイクル､Act脇鯵２２サイクル。－１５－次に、磯磁２機能欠損による影響を調べるためにＨ１７，４２紅ＤＭ挿入変異体(A鯛2-Ｊ)を入手し、その表現蝋の解析を行ったが、種子観の高温繍秘'Zがわずかに低下していること以外には野生型植物との違い！±見いだせなかった。そのため、シロイヌナズナゲノム中にＨｗＬと機能的に重複した遺伝子が存在している可能徹を湾え、Ｆミーノツトネガティブ型タンパク質を利鋼して内在性HsfA2及びH圏fAZと機能;露複したHsfの機能を剛霧することを試みたMliZS/jX2の|§ミナントネガティブ型としてＭｓ融２タンパク霞Ｃ末端に存在する転騨i露,雛化領域及び核外移行シグナルを欠失したＨｓｆＭ△C264を過剰に発現する植物（３５１ＭﾂSjflfM□御）を作出したく図４A)。解析の結果、Ｊ鰍:ＨＶ５４Ｍ⑰解植物は高臘耐性、獲得性高温耐性の低下を示すことを明ちかにした（鰯４Ｂｃ)。また、発現解析によりｺﾞｺﾞｌＷＹ[ViX(2△ｃ２解植物ではＨｓ圦2標的遺伝子の鵬ストレス応響が鱗下していることを明ちかにした（図５九霧騨i撒鯲目ｌＺＷＴＡ醒解ヴ寵ドーョir撒常ｱだ．c）好b鰯２"鋼ブヌaA-Cyl1fsp7aｿﾞｰα》ずgpgひプトfspfO1HSFg，厨S灘ｿ麺ＧｏｉＳプハ優Ｘ２ＥｋｊＰＡ４ＢＦおＡ礒約ＡＨＳ１Ｖ３２Ｈ零iyM24C2艶D8Dl-醸AAj8蹄LSAfiぶＡｌ"ｉＡＺｌＶｍ§Ｓ蕊;…………７－………ｉＩ４ｌＬ:liiiiiiiii調達；劃４鐸S齢ｉｓ殿zAC2S感のm蕊窺壁蜘ルisKiJX2AC2f漣の鑓遜、職ａＤ１ＷＡ織念欝鍛禽凋RpA綴:渉鴬鰯K離鐘篭逮。l(iLS3綴移鍔シグナノをＡ１厨1A:蕊鄭護謎惣綴蜂IWES:鞍ﾀ1Ｊ霧;;iシゲヲール謬緯『Ｃ)掲懸幾５国鶴ｚＺ℃笘欝簿騨瞥潅欝；鱗灘篇よび鋪ａｻﾞ漁猟鍼翅騨輔鹸に溌麹鯉繊）翰し〈悠鑪化魁理;３７℃、１灘灘>錘<C弘各パネノレ擬議し廃鰹溌で３０分瓢ＨＳストし典鑓恕竃汚っだ、曇窺後、２２℃で３籔騨隻灘させた鋤鯛ら料潔ＡＺ徽鱒１８M冒苧の鍵蕊解ｉＲｆ繕慰鱗'○昌鍔22℃で墜齋さ萱施野生蔓鍔よび３５SWS承2Ａ““蕊溺縫鍬りて擢ス津,ス(37℃、】蕊鰯)鑓瑠を霧づた。ＲＮＡ嬢鐸裁、il3KlrA鷲騨i鶴li【箭子の総蕊鍵を単蕊鰯鰯!q序.夢C魚涜によワ鶏擬した､ＰＣＲサイクル歎鯵ＡＣ：豹潔外蛾２４秒ごクル、Ａｃｌﾌﾟ『ｼ趣霧熾イクル癖さら;こ、Ｈ１ｉｊ/》312の発現が蝋ストレス、溌透)〔flHHストレスにより誘導されること、ＪｊｉＷＸ”２植物ではこれらのストレス;こよる生瀞阻霧が綴和されることを兇出した側６)。この結果感ＨＶｌｋｉ２が高#擬耐性以外に、塩耐性、浸透圧耐性{こも関ﾑﾁすることを示しており、植物のＨＶがそのようなストレス応響に関癖することを示したのは本研究が初いてである。また、ストレス応籍以外の畿現型として、ｺﾞｺﾞAMP！Ｍｉｌ２獺物では根外繍片か影のカルス形成、増殖が促進されていることＶ対照的に八 ３耐;Wh1/Z;１２△CW2解では遅延するという結果が縛られた（|割Ｃｑ鰯1Fも！雑Cｌ鋪皀nfIiIcl野＄篭態５？Ｚ認６１２顕験Ｉ萄導Uｒ１２7)。このことはＫＭｌ２がストレス応答以外に細胞の分化、ａ Ｃ瀞ァ霧…，、蕊－－－－．増殖に鶴jiiL-ij-ることを示唆しており、非常に興味深い結染:で：マやＩＺＹ～§躯帆liIiliiinil唇簿12汀,モＡ Ｃｌ鶴一一面●ｑｃｃ－ｃＣ□－－●●の●●o･●ｑ●●●●●●●●●●●●｡１３５７（Ｅｉｊ財塞｡ ２５趨唖托雇?ﾐｮ鷺蕊３ Ｃ 、ＷＴ３３s`:虎S腕？鍵９３５s:J繊鯛２急襲露SJ51L1s鰯璽Ｃ２騨鑓jilS総多プへミソnN,gT・PGKｼＳ５靭含べ滉騨薮ら蕊黛-f志銃身護鯵:ころbﾌﾟ幾蝋髭護発くご漫醇ｉ蕊;震鐙峯島弗診久、鷺蕊塁ストシス侭よる瘤談２鷺蕊の瞼罫夢さ異人i,ユlZ塞言魏蒋a●;‘穫蕊墓鼻李し禺罹鰯舜v1マンニ?－`ｂ；鐘塞禽･;,疋騒譲摸:Ｃ爵璽鯵撞控迫､勤傘Ａ･巷議還i`、学電澱韓覚T-斧:韓挺畿予輔is銭農韓蕊（が…3J壹慈蕊し鹿・張屯竃ツイゲル蔵、「弱總塗篭…ｙ･イク恥、鎧&雛.麹ツィク`j:《罰､索芭塞Sl・錘毅蒼蓑溌を）鋳｢訟鍜詫錘;舞隷`，{X量7内鴻マン二男…ﾉｼ迄擦魯“３潅蕊で？慈舞鴛河inr篭為0.ご>辮了を.翠忌祷打鍾身嘱霧鱈Ｖ錘鰄淑慧2仁;よ窺聡Ｚ”詞:!､ゼマシニiv-ミルを轌奄悪蕩蕊露で鎮祷寵零，澱灘鞍了鰯鞠の錨緯韓（\騨注瓦(,烏:(弓鬮･１輪，蕊Ｖｙ了とらず鑓.薙公ご種禽舎了５()斜1段踊令（;1詮ｉｔ鉾群議爽繩マジニ醇・･･2L署9顎;；錦鐙琵で黛淘煮憲薑．鰹都l曲る篭勃漣學警句翠蕗i,為鱈鐘鞍唇露及火鐸努懸･；４２１汀雲？篭溌２饗蕊黛の建熱iごよるカルス影顛への彰麗（A》1Ｖ1＄躍潅.己？翁燵箪濁吾讐患野裟鷲鰯謹刀穆鶴外譲片ぞ鯵鐘(変．完j〃ス欝毒蕊麹《｡!刺)(二鰺露した翼１．３．５．７Ｂ灘嚢饗溌ＲＮＡ雀蕊遥､、準潅驚鏡貝＝PCRによワムiSj*１２鍵麹ミグーンを涛漏し寵．ＰＣ罰ゲイクル弦漣暫４ザイヶル・鐘-罰；鵡蕊蕊で了溺懲鴦露さ雑兵;野藁驚一藷織型fsi溌鼻’鑓';霧鹸鋤CZS･;・おぶが恩-；蕊議全《も凝外蛾涛を雑鷺し。ﾒﾂﾉi，火蕊露篭蜷(CilV1j寵蕩簿i｣筵‘己；饗鍵欝口２噸懸骸｡:３選鑑．ご亀懇麹．－１６－本研究での結果から、ＨＭ４２が高温ストレスをはじめとする様々なストレス応答において、特にその耐`性獲得に非常に重要な役割を担っていることが明らかになった。また、ストレス応答だけでなく細胞の分化、増殖にも関与することを示唆する結果も得られた。同時に、動物とは対照的に多数のＨＶ遺伝子を有する植物ではこれらが複雑なネットワークを構築し、多様な環境ストレスに対応していることが、特に液ミナントネガテイブ型H1fX2産生植物の実験から強く示唆された。これらの結果はシロイヌナズナに存在する他のＨＶの研究、さらにはシロイヌナズナ以外の植物におけるnＶ研究にも大いに役立つものと期待される。学位論文審査結果の要旨植物は様々な環境ストレスに適応する巧妙な機柵を進化の過程で獲得してきた。熱ショック(ＨＳ)ストレス応答もその一つで、シロイヌナズナゲノムには２１個の熱ショック転写因子遺伝子(Ｈ帥が存在する。中でもＨＭＵはもっとも著しいＨＳストレス応答性が示されているが、植物体内での機能についてはほとんど解析されていなかった。本研究はこのHsi2uについて各種の変異植物体を作出し、その機能の解明を進めたものである。Ｈ三Z42のプロモーター解析、ＨＳｍ２の過剰発現植物体、Ｈ三fXL2のノックアウト株、及びHsfA2タンパク質の転写活性化領域の欠失によるＦミナントネガテイブ型HsfA2産生植物の高温耐性などの解析、更にＨＳｍ２過剰発現植物体のＤＮＡマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析、などを通して、Ｈ己１２２１２が植物体の高温耐性及び獲得性高温耐性に重要な役割を果たしていることを初めて明らかにした。また転写調節因子としてのHsfA2の標的遺伝子を多数同定した。更にHm242は植物体の高温耐`性ばかりでなく、浸透圧ストレスや塩ストレスなど様々なストレス耐性や細胞の分化・増殖にも関与するなど多様な機能を持つことを明らかにした。以上のように、本研究はＨＭ４２遺伝子のＨＳストレスを初めとする多様な機能に関して多数の新事実を明らかにしており、博士論文として充分評価できるものである。－１７－

シロイヌナズナ熱ショック転写因子HsfA2の機能解析

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シロイヌナズナ熱ショック転写因子HsfA2の機能解析

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