取得学位：博士(理学)，学位授与番号：博甲第754号，学位授与年月日：平成17年9月30日,学位授与年：200

Kodera, Noriyuki

古寺 哲幸

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氏名学位の種類学位記番号学位授与の曰付学位授与の要件学位授与の題目論文審査委員(主査）論文審査委員(副査）古寺哲幸博士（理学）博甲第754号平成１７年９月３０日課程博士（学位規則第４条第１項）高速原子間力顕微鏡の開発安藤敏夫（自然科学研究科・教授）鈴木治彦（自然科学研究科・教授），大橋信喜美（自然科学研究科・教授），藤下豪志（自然科学研究科・教授），藤竹正晴（自然科学研究科・助教授）英文要旨Theatomicfbrcemlcroscope（AFM）isapowerMtoolfbrimagmgmdiviClualbiologicalsamplesattachedtoasubstrateinaqueoussolution・HowevemthescanspeedOftheAFMscurrentlyavamableistooslowtocapturethedynamlcprocessesofbiologicalmacromoleculesmrealtimeltisnecessarytodevelopahighspeedatomicfOrcemicroscopefOrimagingthismterestiｎｇｂｅｈａｖｉｏｒ・Ｆｏｒｔｈｉｓｐｕｒｐｏｓｅ，ahigh-speeClscanner〉smancantileverswithhighresonancefrequencies(０６～１．２MHzmliquid）anClsmansprmgconstants（100～３００ｐＮ/nｍ)，anobjective-1enstypeofdeflectiondetectiondevice,ａｎｄsWeralelectromcdeviceswithhighbandwidthhavebeendevelopedhere、IntegrationofthesevariousdeviceshasproducedanAFMthatcancaptuｒｅａｌＯＯｘｌＯＯｐｉｘｅｌ２ｉｍａｇｅｗｉｔｈｉｎ８０ｍsandtherefbrecangenerateamovleconsistmgofmanysuccessivemages（８０msmtervalS)ofasamplemaqueoussolution・TllisisdemonstratedbyimagmgmyosmVmoleculesmovingonmica・Thelligh-speedAFMimaglngwmmakeagreatcontributiontowardunderstandingthepllysicsofbiologicalnano-machinesmthenearfUture．-26-和文要旨水溶液中にある試料の構造をナノ解像度で観察することは、原子間力顕微鏡（AFM）（図１）の誕生によって初めて可能となった。このユニークな特徴は、水溶液中でしか機能しないタンパク質分子を研究する生命科学の分野に大変歓迎され、生体分子プロセスを観察できるのではないかという期待を集めた。ところが、機械走査方式を採用したＡＦＭのイメージング速度は、そのプロセスよりもずっと遅くｕ画像を撮るのに分のオーダーの時間を要する)、ＡＦＭがその期待に応えることはなかった｡ＡＦＭの特徴を最大限に引き出すには、その走査速度を向上させる必要がある。齋LaserDIod⑧Ｂ托劃Ｉ嚇麓ご管｡:竺iｉｉ９ 「 E刺dbaUonP砲、～Mlmr＋麓Canli胞昭sBmp胸壷白頭海鞘》》Ｚ一ＬγＨsGtPUnIir､1１蘂鑿ba獣bBm融鰄 》酌 Ｐ樋、ＤＨＶ⑧rＺＹＸＥｘ1H1墨Ｉ￣ 》》酌図１．原子間力顕微鏡の概念図そこで､ＡＦＭに含まれる全てのデバイスの高速化に取り組み、高速原子間力顕微鏡を開発した。具体的には、共振周波数が高くて柔らかいカンチレバー、極めて小さいカンチレバーの変位を検出することができる光テコ光学系､カンチレバーの振幅を高速に計測する回路、高速に走査しても振動しないスキャナーなどを導入した。その結果、マイカ上に緩やかに固定されたミオシンＶ分子のナノ動態を８０，s/frameの映像として捉えることに世界で初めて成功した（図２)。￣￣－－－－－－－－－－￣￣￣￣■急§』野．嚢・鶴Ｐ 凶＠.国ＳｂｕＳｈｍｂＷＷＳ町ﾊノ静一Ｎ●戯ﾉＨＧｐｄ馨馨’零鷺 瀧ら翁幾１，鞠 審一賎一一一一■－－‐￣￣￣－－－－－－－－－－－－-－－－-－－－－－￣￣-－－－－－ 一 －一 一 一 一 ５０，，１■■■■、図２．高速ＡＩＷＭによって撮影された溶液中のミオシンＶの映像から７枚の連続画像を示す。図中央に典型的なＹ字型をしたミオシンＶ分子が見える。○印で示した１頭部と２頚部の構造形態変化に注目。画像は１枚あたり８０，ｓ（12.5ｈａｍｅ/s）で取得されている。-27-この高速ＡＦＭの誕生に伴い、幾つかの興味ある生体試料系の観察を開始した。ところが、カンチレバー探針が試料をたたく力が強すぎること、フィードバック帯域が十分でないことが原因で､アクチンフィラメントや微小管といったもろい生体試料が連続イメージング中に徐々に破壊されていくという問題に直面した。これは、高速ＡＦＭを生体試料に適用する上で致命的な問題であり、これを克服するための改良を集中的に行ってきた。世界では探針-試料間に働く力の軽減を目的に、Q-contrO1と呼ばれる技術が広く用いられている。しかし､自作のQ-control回路による試験で、この手法が高速走査と両立しないことを突き止めた。そこで､ＰＩＤフィードバックのパラメーターを状況に応じて動的に変化させる“動的ＰＩＤフィードバック制御,，を達成する回路を開発し、探針が試料に軽く接触する状況を安定に維持して高速に走査することを可能にした。さらに､スキャナーの応答速度を高めるために、機械式ダンパーに代わる“電子回路式ダンパー，，を考案・開発し、スキャナーの応答速度を１０倍以上向上させることを達成した。以上の改良によって、もろい試料でも壊さずに長時間安定に連続イメージングすることができるようになり、‘`微小管に沿ってキネシンが一方向に運動する様子，,や“アクチンフイラメントカミミオシンＶと相互作用して一方向に運動する様子,，（図３）を観察することに成功した。これらの観察結果によって、ＡＦＭの走査が、タンパク質分子のATPase及びモーター活性、レールタンパク質の機能に影響を与えないこと、タンパク質分子同士のような弱い相互作用を阻害しないことを示した。図３．アクチンフィラメントがミオシンＶと相互作用して一方向にハープピッチずつ動く様子が観察された（160,s/ｆｒａｍｅで取得した画像を１０枚おきに示す)。アクチンフィラメント、ミオシンＶともにナノメートルオーダーで解像されており、高速ＡＦＭによってタンパク質分子の“構造ダイナミクス,,`情報が提供され始めた。-28-また、タンパク質分子の生理的な作用に伴う構造形態変化とブラウン運動を映像から識別するために、溶液中に混ぜたCageCl化合物に紫外線を照射することによって、観察の途中に特定の溶質を瞬時に導入することができる実験系を構築した。その結果、ミオシンＶに起こったカルモジュリン分子の解離やネック部位の構造変化が､Ｃａ2+やATPの作用で生じたことを明瞭に示す観察結果を得ることに成功した。本研究で新しく開発された高速原子間力顕微鏡は､タンパク質分子の機能発現と構造変化の仕組みを解明するために有用であり、今後多くの分野での活躍が期待される。学位論文審査結果の要旨原子間力顕微鏡（AFM）は物質表面のナノ構造解析などに現在広く利用されている。液中観察も可能なことから生体分子観察に特に有用である。しかし、１画像を撮るのに分のオーダの時間がかかり、効率が悪いばかりでなく、試料の動態を観察できない。古寺君はタンパク質分子のナノメータスケールで起こる機能動態を観察できる高速ＡＦＭの開発を行った。カウンターバランス法、新しいアクティブダンピング法を考案して、高速に走査しても振動を起こさないスキャナーの開発に成功した。また、カンチレバー探針と試料との接触力を極めて小さく維持できる動的ＰＩＤ制御法を考案し、「高速走査」と「試料への優しさ」を両立させることにも成功した。これ以外にもいくつかのアイデアを導入し、弱いタンパク質間相互作用をも乱さずに高速撮影できる高速ＡＦＭを世界に先駆けて開発した。いくつかのタンパク質系の観察も行い、機能動態を最高６０，s/frameの速度でイメージングできることを実証した。生命科学ばかりでなく、ナノ領域で起こる様々な現象の解明にとって有効な顕微鏡であり、その波及効果は極めて大きく、非常に画期的な成果である．予備審査、学位論文の精査、口頭試問を行い、上記の事実を確認し、博士（理学）の学位を授与するに十分な成果であると判断した。I`－／￣-29-

高速原子間力顕微鏡の開発

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