Hossain, Md. Golam

Iwata, Takeo

Mizusawa, Noriko

Yoshimoto, Katsuhiko

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Tokushima University Institutional Repository

内分泌病理学最近の進歩 2007 147 ?????????????????? ?癌抑制因子パラフイブロ、 、 、ンはSV40 large T抗原存在下では細胞増殖促進に働く??吉本 勝彦＊武男’ 7｝くj畢 典子＊ Hossain Md. Gola「n*’徳島大学大学院ヘルスパイオサイエンス研究部分子薬理学分野要 I::, 目パラフィブロミンは副甲状腺機能充進症ー顎腫傷症候群の原因遺伝子HRPT2がコードする 531アミノ酸残基からなる蛋白質である.4種の異なる細胞株を用いてパラフイブロミンを過剰発現させた際の細胞増殖効果を調べたところ， HEK293細胞， NIH3T3細胞でのパラフイブロミン過剰発現は細胞増殖の抑制を示した．一方，SV40 large T抗原（LT）発現細胞株である 293FT細胞と COS7細胞では，パラフイブロミンの過剰発現は細胞増殖の促進を示した.293FT細胞ではパラフィブロミンと LTは相互作用を示し，パラフイブロミンの過剰発現はS期の細胞数を増これらの結果より，癌抑制蛋白質であるパラフイブロミンはLT存在下では細胞増殖を促進させる癌蛋白質としての作用を有することが示唆された．加させた．背 景副甲状腺機能充進症は副甲状腺の腫蕩化および過形成により副甲状腺ホルモンが占めるが，この疾患は，遺伝性ではない孤発性の発症がほとんどをごく稀に遺伝性の副甲状腺機能充進症も存在する．遺伝性の副甲状腺機過剰分泌する疾患である．ホルモンと臨床 Vol.56増刊号能充進症は，多発性内分泌腫蕩症1型および2A型，家族性副甲状腺機能充進症，148 HPT-JTは副甲副甲状腺機能充進症ー顎腫蕩症候群（HPT-JT）が知られている．状腺腫蕩と顎線維腫を生じ，他の孤発性および遺伝性副甲状腺機能充進症の腫揚がHPT-JTや孤発性副甲状腺癌では l番染色体上に位置する HRPT2の匪細胞性あるいは体細胞性変異が高頻度に検出されること I）およびHRPT2は癌抑制遺伝子として作用していることが明らかにされている．パラフイブロミンは HRPT2がコードするほとんど良性であるのに対し，副甲状腺癌の頻度が高い点に特色を有する．そのC末端は酵母Cdc73蛋531残基のアミノ酸より構成される核蛋白質であり，Rtflと酵母Pafl複合体を白と相同性を有する.Cdc73蛋白はPafl,Leol, Ctr9, パラフイブロRNAポリメラーゼEの転写調節に関与していることから，形成し，ヒト Pafl複合体の構成蛋白質であミンは酵母Cdc73蛋白のヒトホモログであり，Ctr9, Leol, る可能性が示唆されている．実際にパラフイブロミンは酵母Pafl,?????????????????? ??????????? ? ? ? ? ?ヒト Pafl複合体の生理作用およびパラフイブロミンが関わる癌抑制機序に関しては現時点では不明である．Rtflのヒトホモログと相互作用することが報告されているが日）HEK293, 293FT, パラフイブロミンが細胞増殖に与える影響を調べる目的で，NIH3T3の各細胞株にパラフイブロミンを過剰発現させた際の細胞増殖に対する影響を検討したところ，予想通り HEK293とNIH3T3の細胞株でのパラフイブロミン過剰発現は細胞増殖を抑制したことから，パラフイブロミンが細胞増殖抑制能を示す癌抑制蛋白質であることが示唆された．一方，驚くべきことに293FTとCOS7の細胞株でのパラフイブロミンの過剰発現は逆に細施増殖を促進させた.293FTとCOS7はともにSimianvirus 40 (SV40）のlargeT抗原（LT)により形質転換されている細胞株である.SV40は感染した宿主で癌蛋白質であるLTを産生し，宿主の様々な転写因子やDNA複製に関わる因子と LTが相互作用し，宿主の遺伝子発現や増殖を変化させる5）.特にp53やpRbのような細胞周期をCOS7, LTがヒトの癌化に直接関与する可能性は少ないが，細胞を用いた基礎研究の分野ではLTは形質転換の有益なツールとしてよく用いられている．我々は， 293FTやCOS7細胞株でのパラフイブロ ミン過剰発現による細胞増殖促進はLTとパラフイブロミンの相互作用により引き起こされると仮説を立てた．その仮説を立証すべくパラフイブロミンと LTの相互作用を検討した．調節する癌抑制蛋白質と相互作用することはよく知られている6)_149 内分泌病理学最近：の進歩 2007－・－ HEK293 + Vector ・0・HEK293+ PF ー喧F・293FT+ Vector • ・6.・293FT+ PF －ーートー NIH3T3+ Vector －－ロ・・ NIH3T3+ PF －・ー園 COS7+ Vector ．・0・COS7+ PF 0 ・・・φ・・・・・・ φ2.0 1. 5 1. 0 0.5 （??? ?）?。96 48 72 経過時間（hr)24 パラフィブロミン（PF）を過剰発現させた各細胞の増殖曲親細胞導入時から 24,48, 72, 96時間後の細胞数を CellCounting Kit-8 (DOJINDO 社）を用いて測定した．図1果結2. 1 ）パラフィブロミンは LT発現細胞株の細胞増殖を促進するパラフイブロミンの癌抑制蛋白質としての機能を調べるために， HEK293, 293FT, NIH3T3の各細胞株にパラフイブロミンを過剰発現させた際の細胞数の増COS7, NIH3T3の各細胞株に対する遺伝COS7, 293FT, HEK293, （図 1).減を調べた80, それぞれ80,子導入効率を GFP発現ベクターの導入により検討したところ，パラフィブロミン過剰発現細胞は対照とHEK293細胞では，20%であった．80, また NIH3T3細した空ベクター導入細胞と比べ，細胞増殖が有意に抑制された．パラフイブロミン過剰発現により細胞でも遺伝子導入効率が悪いにもかかわらず，293FTや COS7の細胞株にパラフイブロミン一方，胞増殖の抑制が認められた．293FTや COS7はLT発この効果はパラフイブロミンと LTの相互作用によるもを過剰発現させたところ，細胞増殖が逆に促進された．現細胞株であることから，のと仮説を立てた．150 ホルモンと臨床 Vol.56増刊号表1 パラフイブロミン過剰発現293FT細胞の各細胞周期の細胞数の割合293FT + vector 293FT+PF Gl期（%） s期（%） G2/M期（%）36. 9 26.4 HEK293 ';,C'<"o.,_ のぷ、44.8 49.4 293FT ~ c、も. のふ14.8 21.5 WB: anti-LT WB: anti-FLAG 図2 パラフィブロミン（PF）と LTの相互作用次にパラフイブロミンの過剰発現が細胞周期に与える影響を調べるために，パラフイブロミン過剰発現293FT細胞の各細胞周期の細胞数の割合をフローサイトメトリーにより測定した（表1）.対照とした空ベクター導入293FT細胞の各細胞周期のパラメーターと比較して，パラフイブロミン過剰発現293FT細胞は S期やG2/M期の細胞数の増加が観察されたことから，パラフイブロミンはLT発現細胞ではS期への移行を促進することが示唆された．このことからも， LT発現細胞株ではパラフイブロミン過剰発現は細胞増殖を促進することが確認された．2）パラフィブロミンは LTと相互作用するパラフィブロミンと LTの相互作用を調べるために， FLAGタグを付加したパラフィブロミンを発現させたHEK293および293FT細胞の抽出物を抗FLAG抗体により免疫沈降し，免疫沈降画分の抗LT抗体によるウエスタンプロッテイングを行った.LT発現細胞株である 293FT細胞でLTとパラフイブロミンの相互作用が検出された（図2）.一方， LT非発現細胞株である HEK293細胞では相互作用は検出きれなかった．また293FT細胞で抗LT抗体を用いた免疫沈降，および、抗パラフイブロミ ンー抗体によるウエスタンブロッテイングにより内因性のパラフイプロミンと LTとの相互作用が確認された．パラフイプロミンはPafl,Leol, Ctr9のヒトホモログとヒト Pafl複合体を形成する．前述したパラフィブロミンと LTとの相互作用は，ヒト Pafl複合体と LTの相互作用であるのか，パラフイブロミン単独と LTの相互作用であるのか調べる内分泌病理学最近の進歩 2007 151 NLS FLAG-PF IFLAGI ・FLAG『 PF,-23IFL:AG1FLAG-PF,-3時 IFL'AGI • FLAG-PF1・掛 IFbAGI ・FLAG-PF1-•11 rRLA:GIFLAG-PF1－，曲 l:FEAG.I ・礼 AG-PF2,s-531医藍亙FLAG-PF2ゆ拙 IFUAGI I FLAG-LT 医冨誼FLAG’LT，胡医冨亙FLAG-LT,-,s, [fi翠2FLAG-LT，・醐 ~亙FLAG-LT 10-108 国亙宣FLAG-LT拙・706 [ FLAG-LT再川副 I E璽詔図3 パラフィブロミン（PF）と LTの結合領域の同定LTとの結合。× 0 0 0 0 0 0 PFとの結合] 708 0 。× 0 E因。。実験に用いたPFとLTの各欠損変異体の模式図と相互作用の有無を示す．ために， HAタグを付加した各ヒト Pafl複合体構成蛋白質を発現させた293FT細胞の抽出物を抗HA抗体で免疫沈降し，抗LT抗体によるウエスタンプロッティングを行ったところ，すべてのヒト Pafl複合体構成蛋白質と LTの相互作用が確認された．このことから， LTは細胞内でヒト Pafl複合体と相互作用していることが示唆された．LTと直接相互作用するヒト Pafl複合体の構成蛋白質を同定するため，加 vitroでの翻訳系を用いてLTおよびヒト Pafl複合体の構成蛋白質を合成し， LT－各ヒトPafl複合体構成蛋白質問の相互作用を検討したところ，パラフイブロミン，Rtflのヒトホモログと LTの相互作用が確認されたが，その他のヒト Pafl複合体の構成蛋白質とは相互作用が認められなかった.Rtflは酵母Pafl複合体の構成蛋白質であるが，ヒトではその他のPafl複合体構成蛋白質との結合は非常に弱く，免疫沈降およびウエスタンプロッティングの検出系ではその相互作用は確認できない．このため， LTー ヒト Rtflホモログ聞の相互作用はヒト Pafl複合体以外の作用である可能性がある．この結果により LTはパラフイプロミンと直接相互作用していることカf明らかになった．152 ホルモンと臨床 Vol.56増刊号次にパラフィブロミンと LTのそれぞれの結合部位の同定を試みた.N末端あるいは， C末端に FLAGタグを付加した数種のパラフイブロミンおよびLTの欠損変異体の発現ベクターを構築した．各パラフイブロミン欠損変異体発現293FT細胞の抗FLAG抗体を用いた免疫沈降および抗LT抗体によるウエスタンプロッテイングにより，パラフイブロミンのLTとの相互作用に必要な部位を同定した．パラフイブロミンの218-263アミノ酸配列の間でLTと相互作用していることが確認された．同様にLTのパラフイブロミン結合部位は361-481アミノ酸間であることが示された（図3).察パラフィブロミンは癌抑制蛋白質と考えられている．多くの癌抑制蛋白質は，変異，欠失，メチル化などによる不活化の結果，細胞周期のチェックポイント機構が正常に機能しなくなり，その結果，細胞増殖促進を引き起こすと考えられている．実際に，パラフイプロミンは細胞周期促進因子である cyclinDlの発現を抑制することにより，細胞増殖を抑制するという報告があるべ本研究で，我々はパラフイブロミンを HEK293や NIH3T3細胞株に過剰発現させることにより，細胞増殖が抑制されるということを再確認したが， LT発現細胞株である 293FTや COS7の細胞株では逆にパラフイブロミン過剰発現は細胞増殖を促進することを見出した．LT発現細胞株ではパラフイブロミンの過剰発現はパラフイブロミンの細胞増殖抑制能を打ち消しているのではなく，むしろ細胞増殖促進の方向に向かわせる．癌抑制蛋白質が特定の状況下では逆に癌蛋白質としての作用を示す例として， Krtippe卜like factor (KLF) familyのメンバーである KLF4は癌抑制蛋白質としての作用を示すが，特定の条件下では癌蛋白質として作用することが報告されている8）.また多発性内分泌腫蕩症1型の原因遺伝子産物として同定されたMENINは癌抑制蛋白質の性質を有するが，転座により白血病を引き起こす癌蛋白質である Mixed-Line-age Leukemia (MLL)に結合し， MLLによる癌化機構に必須な因子でもあることが報告されている9）.これらの例のように，本来癌抑制蛋白質であるパラフイブロミンも LT発現細胞では癌蛋白質としての作用を示すと考えられる．パラフイブロミンは酵母Cdc73と32%の相向性を有している.Cdc73はPafl,Leol, Ctr9, Rtflとともに酵母Pafl複合体の構成蛋白質としてRNAポリメラーゼEの転写活性を調節している．パラフィブロミンはこれらの酵母ホモログとヒトPafl複合体を形成し，ヒストン H3のメチル化を行い，転写反応を調節していると内分泌病理学最近の進歩 2007 153 考えられる．ヒト Paflホモログの過剰発現は細胞増殖を引き起こすという報告があることから lペヒト Pafl複合体はパラフイブロミンが有する細胞増殖抑制能とヒト Paflホモログが有する細胞増殖促進能で均衡状態にあり， LTとの相互作用によりパラフイブロミンの細胞増殖抑制能が消失する結果，その均衡が崩れ，細胞増殖促進に働くという可能性がある．一方，ヒト Paflホモログやパラフイブロミンがヒト Pafl複合体とは関係なく，独自に細胞増殖に関与する可能性も否定できないため，さらなる研究が今後必要で、ある．最近，パラフイブロミンは WntシグナルのFカテニンと相互作用し， Wntシグナルをまさに調節しているという報告がなされた11). Wntシグナルは様々な腫蕩化に関与しており，パラフイブロミンは LT発現細胞では Wntシグナルを増強する役割があるのかもしれない．パラフイブロミンの不活化によりその発現が充進することが知られている cyclinDlはWntシグナルの標的遺伝子であることから， LT存在下でパラフイブロミンはcyclinDlの発現上昇を引き起こす可能性がある．そこでパラフイブロミン過剰発現293FT細胞でcyclinDl遺伝子発現を検討したが，mRNAレベルでの変動は認められなかった．今後はパラフイブロミンが他の Wntシグナルの標的遺伝子発現に影響を及ぼすか調べる必要がある．LTはSV40が感染した宿主細胞の蛋白質と相互作用することで，その蛋白質の機能を消失させることが知られている．特に p53やpRbとの相互作用により，細胞周期， DNA損傷のチェックポイント機構に傷害を生じさせることはよく知られている.LTのアミノ酸配列 103-107間にある LxCxEモチーフは pRBファミリーと結合することが知られているが1ペ今回，我々が同定したパラフイブロミン結合領域はアミノ酸配列 361-481間にあり， LTとパラフイブロミンの相互作用はpRBを介さないことが示唆される（図 4）.また LTのC末端側のアミノ酸配列351-450および533-626聞に p53結合領域が存在するがlペパラフイブロミン結合領域はそのーっと一致する．しかしパラフイブロミンと LTは直接結合することがin vitroの実験で確認されていることから，パラフイブロミンとの結合がp53を介している可能性は低い．LT存在下でパラフイブロミンが細胞増殖促進させ， LTとパラフイブロミンの相互作用が認められるという事実は，その相互作用が細胞増殖促進を引き起こしている可能性が高いことを意味する．実際， LT結合部位を欠損させたパラフイブロミンを LT発現細胞株に過剰発現させても，細胞増殖の促進は認められなかった．しかしこの変異体はパラフイブロミンが本来有する機能をも失っている可能性も否定できないため，パラフイブロミンと LTの相互作用が細胞増殖促進に必要な条件154 ホルモンと臨床 Vol.56増刊号ヒト Pafl複合体ヒト Pafl複合体結合領域227I核移行シグナル 233 PF 351 図4 パラフイプロミン（PF）と LTの機能部位ヒト Paflホモログ（hPafl），ヒト Leolホモログ（hLeol)，ヒト Ctr9ホモログ（hCtr9），ヒトRtflホモログ（hRtfl）と PFはヒト Pafl複合体を形成する．であるか否かは今後の課題である．我々はパラフイブロミンのLT結合部位がアミノ酸配列218-263に存在することを示したが，この部位はパラフイブロミンのFカテニン結合部位と一致する1人このことは，パラフイブロミンのアミノ酸配列218-263は転写活性調節因子と結合する共通モチーフである可能性を示唆する．パラフイブロミンはLTやFカテニンの標的遺伝子の転写活性を増強することで，細胞増殖を制御していることも充分考えられることである．以上より，パラフイブロミンは異なる 2つの経路で細胞増殖を制御していると考えられる. 1つはHRPT2の変異によるパラフイ ブロミンの不活化により細胞増殖抑制能が消失し，細胞増殖を促進させる機構で，パラフイブロミンの癌抑制蛋白質としての機能によるものである．もう 1つは今回示したように， LT存在下で、パラフイブロミンは細胞増殖を促進させるというパラフイブロミンの癌蛋白質としての内分泌病理学最近の進歩 2007 155 作用によるものである．今後はLT以外にパラフイブロミンを癌蛋白質として作用させる因子の同定，またLT存在下でのパラフイブロミンによる細胞増殖促進に関わる分子の同定などを行う必要がある．後文献1) Mizusawa N, et al: Clin Endocrinol (Oxf) 65: 9-16, 2006. 2) Rozenblatt-Rosen 0, et al : Mol Cell Biol 25 : 612-620, 2005. 3) Y art A et al : Mo! 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癌抑制因子パラフィブロミンはSV40 large T抗原存在下では細胞増殖促進に働く

http://repo.lib.tokushima-u.ac.jp/files/public/11/114317/20200304105313812310/ce_56_147.pdf

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