While especially early research focused on the small portion of the human genome that encodes proteins, it became apparent that molecules responsible for many key functions were also encoded in the remaining regions.
Originally, non-coding RNAs, i.e., molecules that are not translated into proteins, were thought to be composed of only two classes (ribosomal RNAs and transfer RNAs). However, starting from the early 1980s many other non-coding RNA classes were discovered. In the past two decades, small non-coding RNAs (sncRNAs) and in particular microRNAs (miRNAs), have become essential molecules in biological and biomedical research.
In this thesis, five aspects of miRNA research have been addressed. Starting from the development of advanced computational software to analyze miRNA data (1), an in-depth understanding of human and non-human miRNAs was generated and databases hosting this knowledge were created (2). In addition, the effects of technological advances were evaluated (3). We also contributed to the understanding on how miRNAs act in an orchestrated manner to target human genes (4). Finally, based on the insights gained from the tools and resources of the mentioned aspects we evaluated the suitability of miRNAs as biomarkers (5).
With the establishment of next-generation sequencing, the primary goal of this thesis was the creation of an advanced bioinformatics analysis pipeline for high-throughput miRNA sequencing data, primarily focused on human. Consequently, miRMaster, a web-based software solution to analyze hundreds sequencing samples within few hours was implemented. The tool was implemented in a way that it could support different sequencing technologies and library preparation techniques. This flexibility allowed miRMaster to build a consequent user-base, resulting in over 120,000 processed samples and 1,5 billion processed reads, as of July 2021, and therefore laid out the basis for the second goal of this thesis. Indeed, the implementation of a feature allowing users to share their uploaded data contributed strongly to the generation of a detailed annotation of the human small non-coding transcriptome. This annotation was integrated into a new miRNA database, miRCarta, modelling thousands of miRNA candidates and corresponding read expression profiles. A subset of these candidates was then evaluated in the context of different diseases and validated. The thereby gained knowledge was subsequently used to validate additional miRNA candidates and to generate an estimate of the number of miRNAs in human. The large collection of samples, gathered over many years with miRMaster was also integrated into a web server evaluating miRNA arm shifts and switches, miRSwitch. Finally, we published an updated version of miRMaster, expanding its scope to other species and adding additional downstream analysis capabilities.
The second goal of this thesis was further pursued by investigating the distribution of miRNAs across different human tissues and body fluids, as well as the variability of miRNA profiles over the four seasons of the year. Furthermore, small non-coding RNAs in zoo animals were examined and a tissue atlas of small non-coding RNAs for mice was generated.
The third goal, the assessment of technological advances, was addressed by evaluating the new combinatorial probe-anchor synthesis-based sequencing technology published by BGI, analyzing the effect of RNA integrity on sequencing data, analyzing low-input library preparation protocols, and comparing template-switch based library preparation protocols to ligation-based ones. In addition, an antibody-based labeling sequencing chemistry, CoolMPS, was investigated.
Deriving an understanding of the orchestrated regulation by miRNAs, the fourth goal of this thesis, was pursued in a first step by the implementation of a web server visualizing miRNA-gene interaction networks, miRTargetLink. Subsequently, miRPathDB, a database incorporating pathways affected by miRNAs and their targets was implemented, as well as miEAA 2.0, a web server offering quick miRNA set enrichment analyses in over 130,000 categories spanning 10 different species. In addition, miRSNPdb, a database evaluating the effects of single nucleotide polymorphisms and variants in miRNAs or in their target genes was created.
Finally, the fifth goal of the thesis, the evaluation of the suitability of miRNAs as biomarkers for human diseases was tackled by investigating the expression profiles of miRNAs with machine learning. An Alzheimer's disease cohort with over 400 individuals was analyzed, as well as another neurodegenerative disease cohort with multiple time points of Parkinson's disease patients and healthy controls. Furthermore, a lung cancer cohort covering 3,000 individuals was examined to evaluate the suitability of an early detection test. In addition, we evaluated the expression profile changes induced by aging on a cohort of 1,334 healthy individuals and over 3,000 diseased patients.
Altogether, the herein described tools, databases and research papers present valuable advances and insights into the miRNA research field and have been used and cited by the research community over 2,000 times as of July 2021.Während insbesondere die frühe Genetik-Forschung sich auf den kleinen Teil des menschlichen Genoms konzentrierte, der für Proteine kodiert, wurde deutlich, dass auch in den übrigen Regionen Moleküle kodiert werden, die für viele wichtige Funktionen verantwortlich sind.
Ursprünglich ging man davon aus, dass nicht codierende RNAs, d. h. Moleküle, die nicht in Proteine übersetzt werden, nur aus zwei Klassen bestehen (ribosomale RNAs und Transfer-RNAs). Seit den frühen 1980er Jahren wurden jedoch viele andere nicht-kodierende RNA-Klassen entdeckt. In den letzten zwei Jahrzehnten sind kleine nichtcodierende RNAs (sncRNAs) und insbesondere microRNAs (miRNAs) zu wichtigen Molekülen in der biologischen und biomedizinischen Forschung geworden.
In dieser Arbeit werden fünf Aspekte der miRNA-Forschung behandelt. Ausgehend von der Entwicklung fortschrittlicher Computersoftware zur Analyse von miRNA-Daten (1) wurde ein tiefgreifendes Verständnis menschlicher und nicht-menschlicher miRNAs entwickelt und Datenbanken mit diesem Wissen erstellt (2). Darüber hinaus wurden die Auswirkungen des technologischen Fortschritts bewertet (3). Wir haben auch dazu beigetragen, zu verstehen, wie miRNAs koordiniert agieren, um menschliche Gene zu regulieren (4). Schließlich bewerteten wir anhand der Erkenntnisse, die wir mit den Tools und Ressourcen der genannten Aspekte gewonnen hatten, die Eignung von miRNAs als Biomarker (5).
Mit der Etablierung der Sequenzierung der nächsten Generation war das primäre Ziel dieser Arbeit die Schaffung einer fortschrittlichen bioinformatischen Analysepipeline für Hochdurchsatz-MiRNA-Sequenzierungsdaten, die sich in erster Linie auf den Menschen konzentriert. Daher wurde miRMaster, eine webbasierte Softwarelösung zur Analyse von Hunderten von Sequenzierproben innerhalb weniger Stunden, implementiert. Das Tool wurde so implementiert, dass es verschiedene Sequenzierungstechnologien und Bibliotheksvorbereitungstechniken unterstützen kann. Diese Flexibilität ermöglichte es miRMaster, eine konsequente Nutzerbasis aufzubauen, die im Juli 2021 über 120.000 verarbeitete Proben und 1,5 Milliarden verarbeitete Reads umfasste, womit die Grundlage für das zweite Ziel dieser Arbeit geschaffen wurde. Die Implementierung einer Funktion, die es den Nutzern ermöglicht, ihre hochgeladenen Daten mit anderen zu teilen, trug wesentlich zur Erstellung einer detaillierten Annotation des menschlichen kleinen nicht-kodierenden Transkriptoms bei. Diese Annotation wurde in eine neue miRNA-Datenbank, miRCarta, integriert, die Tausende von miRNA-Kandidaten und entsprechende Expressionsprofile abbildet. Eine Teilmenge dieser Kandidaten wurde dann im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten bewertet und validiert. Die so gewonnenen Erkenntnisse wurden anschließend genutzt, um weitere miRNA-Kandidaten zu validieren und eine Schätzung der Anzahl der miRNAs im Menschen vorzunehmen. Die große Sammlung von Proben, die über viele Jahre mit miRMaster gesammelt wurde, wurde auch in einen Webserver integriert, der miRNA-Armverschiebungen und -Wechsel auswertet, miRSwitch. Schließlich haben wir eine aktualisierte Version von miRMaster veröffentlicht, die den Anwendungsbereich auf andere Spezies ausweitet und zusätzliche Downstream-Analysefunktionen hinzufügt.
Das zweite Ziel dieser Arbeit wurde weiterverfolgt, indem die Verteilung von miRNAs in verschiedenen menschlichen Geweben und Körperflüssigkeiten sowie die Variabilität der miRNA-Profile über die vier Jahreszeiten hinweg untersucht wurde. Darüber hinaus wurden kleine nichtkodierende RNAs in Zootieren untersucht und ein Gewebeatlas der kleinen nichtkodierenden RNAs für Mäuse erstellt.
Das dritte Ziel, die Einschätzung des technologischen Fortschritts, wurde angegangen, indem die neue kombinatorische Sonden-Anker-Synthese-basierte Sequenzierungstechnologie, die vom BGI veröffentlicht wurde, bewertet wurde, die Auswirkungen der RNA-Integrität auf die Sequenzierungsdaten analysiert wurden, Protokolle für die Bibliotheksvorbereitung mit geringem Input analysiert wurden und Protokolle für die Bibliotheksvorbereitung auf der Basis von Template-Switch mit solchen auf Ligationsbasis verglichen wurden. Darüber hinaus wurde eine auf Antikörpern basierende Labeling-Sequenzierungschemie, CoolMPS, untersucht.
Das vierte Ziel dieser Arbeit, das Verständnis der orchestrierten Regulation durch miRNAs, wurde in einem ersten Schritt durch die Implementierung eines Webservers zur Visualisierung von miRNA-Gen-Interaktionsnetzwerken, miRTargetLink, verfolgt. Anschließend wurde miRPathDB implementiert, eine Datenbank, die von miRNAs und ihren Zielgenen beeinflusste Pfade enthält, sowie miEAA 2.0, ein Webserver, der schnelle miRNA-Anreicherungsanalysen in über 130.000 Kategorien aus 10 verschiedenen Spezies bietet. Darüber hinaus wurde miRSNPdb, eine Datenbank zur Bewertung der Auswirkungen von Einzelnukleotid-Polymorphismen und Varianten in miRNAs oder ihren Zielgenen, erstellt.
Schließlich wurde das fünfte Ziel der Arbeit, die Bewertung der Eignung von miRNAs als Biomarker für menschliche Krankheiten, durch die Untersuchung der Expressionsprofile von miRNAs anhand von maschinellem Lernen angegangen. Eine Alzheimer-Kohorte mit über 400 Personen wurde analysiert, ebenso wie eine weitere neurodegenerative Krankheitskohorte mit Parkinson-Patienten an mehreren Zeitpunkten der Krankheit und gesunden Kontrollen. Außerdem wurde eine Lungenkrebskohorte mit 3.000 Personen untersucht, um die Eignung eines Früherkennungstests zu bewerten. Darüber hinaus haben wir die altersbedingten Veränderungen des Expressionsprofils bei einer Kohorte von 1.334 gesunden Personen und über 3.000 kranken Patienten untersucht.
Insgesamt stellen die hier beschriebenen Tools, Datenbanken und Forschungsarbeiten wertvolle Fortschritte und Erkenntnisse auf dem Gebiet der miRNA-Forschung dar und wurden bis Juli 2021 von der Forschungsgemeinschaft über 2.000 Mal verwendet und zitiert
