Infertility affects 10 15% of couples and approximately 50% of cases are linked
to male factor infertility. In recent decades, many studies have found that genetic
causes, aberrant patterns of DNA methylation and histone modification have been
shown to play a role in male infertility or fecundity decline, and have been identified in
15 30% of infertile males. Besides, several studies have illustrated that changes in
the DNA methylation of specific genes in germ cells are linked with oligozoospermia,
reduced progressive sperm motility, and abnormal sperm morphology. Likewise, a
recent study detected aberrant in DNA methylation levels for genes involved in the
spermatogenic program and located outside of imprinted regions in poor quality
spermatozoa. The present thesis aimed (I) to determine whether sperm DNA
methylation level at CpG dinucleotides is different in males suffering from a reduction
in fecundity compared to proven fertile males, (II) to determine the relationship
between changes in sperm DNA methylation levels in this gene and abnormalities in
semen parameters, (III) to identify whether cigarette smoking alters sperm DNA
methylation patterns and to determine whether this alteration in sperm DNA
methylation is associated with basic semen parameters like sperm count, sperm
motility, and morphology, (IV) to evaluate the association between the gene
expressions level for the genes included in this study and semen parameters,
addition to assessing the correlation between the gene expression and the alteration
in spermatozoa DNA methylation levels. The strategy of this research was applied as
the following: Infinium 450K BeadChip array was used as screening study, to
evaluate the variation in sperm DNA methylation levels between cases and controls
groups. Then the differentially methylated CpGs (DMC) underwent to deep bisulfite
sequencing to validate on large cohort samples (as validation study). In the end,
Quantitative RT-PCR assay was used to evaluate the expression of the gene
included in this study. According to the results of the validation study, the
bioinformatics analysis found that more than one CpG showed a difference in the
methylation level addition to CpGs obtained from the screening study between
subfertile males and proven fertile males. Some of this CpGs were located in gene
bodies and CpG islands (PRICKLE2, ALS2CR12, ALDH3B2, PTGIR, KCNJ5, MLPH,
SMC1b, GAA, PRRC2A, MAPK8/P3, PDE11A, ANXA2, CGß, and TYRO3), while the other CpGs were located in intergenic regions. Besides, a significant correlation was
found between the methylation levels at the CpGs in genes related amplicon of
subfertile males and semen parameters like sperm count, a percentage of total
sperm motility, the percentage of progressive motility, a percentage of nonprogressive
motility, a percentage of immotile sperm and sperm vitality. On the other
hand, this study showed more than one CpGs have significant differences in
methylation levels between current smokers as compared to never smoked males
like CpGs namely cg07869343 and cg19169023, which are located in the MAPK8IP3
and TKR genes. Moreover, the results showed a significant correlation between the
methylation levels at more than one CpGs in the genes related amplicon of current
smoker males and semen parameters such as sperm count, the percentage of total
sperm motility, a percentage of sperm immotile, a percentage of progressive motility,
and a percentage of sperm normal form. In conclusion, this study identified CpGs
related to different genes have an alteration in sperm DNA methylation levels in
cases compared to controls groups. In addition, an association between changes in
the methylation level for these CpGs and different semen parameters was found. The
observed variations may have an influence on sperm phenotype. More studies are
needed to clarify the mechanisms relating to these alterations and to discover their
significance and functional consequences for male fecundityUnfruchtbarkeit betrifft 10 - 15% der Paare und etwa 50 % der Fälle werden an
männliche Faktorunfruchtbarkeit verbunden. In den letzten Jahrzehnten haben viele
Studien haben festgestellt, dass die genetische Ursachen, abweichendes Muster der
DNA-Methylierung und Histonmodifikation gezeigt haben, eine Rolle in der
männlichen Unfruchtbarkeit oder Fruchtbarkeit Rückgang zu spielen, und haben in
15 identifiziert wurde - 30% der infertile Männer. Neben, mehrere Studien haben
gezeigt, dass die Veränderungen in der DNA-Methylierung spezifischer Gene in
Keimzellen verbunden sind mit oligozoospermie, reduzierte progressive
Beweglichkeit der Spermien, die Morphologie der Spermien und abnormal. Ebenso
wird eine aktuelle Studie entdeckt aberrante DNA-Methylierung von Genen, die in die
spermatogene programm beteiligten und außerhalb der geprägten Regionen in
schlechter Qualität der Spermien. Die vorliegende Arbeit soll (I), um zu bestimmen,
ob die Spermien-DNA Methylierung bei CpG dinucleotides verschiedenen in Männer
leiden unter einer Verringerung der Fruchtbarkeit ist im Vergleich zu den bewährten
fruchtbare Männer, (II) die Beziehung zwischen Veränderungen der Spermien-DNA
Methylierung Ebenen in diesem Gen und Missbildungen im Samen Parameter zu
bestimmen, (iii) um zu ermitteln, ob das Rauchen verändert Spermien-DNA
Methylierungsmuster und zu ermitteln, ob diese Änderung der Spermien-DNA
Methylierung mit grundlegenden Samen Parameter wie die Zahl der Spermien, die
Beweglichkeit der Spermien zugeordnet ist, und die Morphologie, (iv) die Assoziation
zwischen den gen Ausdrücke für die Gene, die in dieser Studie und Samen
Parameter enthalten, zusätzlich zu der Bewertung der Korrelation zwischen der
Genexpression und der Veränderung der Spermien-DNA-Methylierung. Die Strategie
dieser Forschung war, wie die Folgenden: Infinium 450K BeadChip Array war als
screening Studie verwendet, die Veränderung der Spermien-DNA Methylierung
Ebenen zwischen Fällen und Kontrollen Gruppen zu bewerten. Dann die differentiell
methylierte CpGs (DMC) wurde zu tief Bisulfite Sequencing auf große Kohorte
Proben (als validierungsstudie) bestätigen. Am Ende, Quantitative RT-PCR Assay
wurde verwendet, um die Expression des Gens in dieser Studie zu bewerten. Nach
den Ergebnissen der Validierungsstudie, die bioinformatik Analyse ergab, dass mehr
als ein CpG zeigten einen Unterschied in der methylierung Ebene neben der CpGs
vom screening Studie zwischen subfertile Männer und bewährte fruchtbare Männer gewonnen. Einige dieser CpGs wurden in gen Stellen und CpG-Inseln (KRIBBELN 2,
ALS 2 CR 12, ALDH3 B2, PTGIR, Kcnj 5, MLPH, SMC 1b, GAA, PRRC2A, MAPK 8 IP3, PDE11A, ANXA2, CGß und TYRO3), während die anderen CpGs in intergenic
Regionen entfernt wurden. Außerdem wurde eine signifikante Korrelation zwischen
der Methylierung der CpGs in Genen amplikon der Subfertile Männer und Samen
Parameter wie die Zahl der Spermien gefunden wurde, einen Prozentsatz der
gesamten Beweglichkeit der Spermien, der Prozentsatz der Spermienbeweglichkeit,
ein Anteil von Nicht-progressive Motilität, einen Prozentsatz der Immotile Spermien
und Spermien Vitalität. Auf der anderen Seite ist diese Studie zeigte mehr als ein
CpGs haben signifikante Unterschiede in der Methylierung Ebenen zwischen
Rauchern gegenüber nie geraucht Männchen wie CpGs nämlich cg cg 07869343
und 19169023, die in der Mapk 8 IP3 und TKR Gene befinden. Darüber hinaus. Die
Ergebnisse zeigten einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Methylierung
Niveaus an mehr als einem CpGs in den Genen amplikon der aktuellen Raucher
Männer und Samen Parameter wie die Zahl der Spermien, der Prozentsatz der
gesamten Beweglichkeit der Spermien, einen Prozentsatz der Spermien Immotile,
einen Prozentsatz der Spermienbeweglichkeit und ein Prozentsatz der Spermien
normale Form an. Im Ergebnis dieser Studie identifizierten CpGs im Zusammenhang
mit verschiedenen Genen haben eine Veränderung in der Spermien-DNA
Methylierung Ebenen in Fällen verglichen mit Kontrollen Gruppen. Zusätzlich wird
eine Verbindung zwischen den Veränderungen in der Methylierung für diese CpGs
und verschiedenen Samen Parameter gefunden wurde. Die beobachteten
Abweichungen können einen Einfluss auf die spermien Phänotyp. Weitere Studien
sind notwendig, um die Mechanismen, die im Zusammenhang mit diesen
Veränderungen und deren Bedeutung und funktionelle Konsequenzen für männliche
Fruchtbarkeit zu entdecken, zu klären