Fluorescent dyes and genetically encoded fluorescence indicators (GEFI) are common tools for visualizing concentration changes of specific ions and messenger molecules during intra- as well as intercellular communication. While fluorescent dyes have to be directly loaded into target cells and function only transiently, the expression of GEFIs can be controlled in a cell and time-specific fashion, even allowing long-term analysis in living organisms. Dye and GEFI based fluorescence fluctuations, recorded using advanced imaging technologies, are the foundation for the analysis of physiological molecular signaling. Analyzing the plethora of complex fluorescence signals is a laborious and time-consuming task. An automated analysis of fluorescent signals circumvents user bias and time constraints. However, it requires to overcome several challenges, including correct estimation of fluorescence fluctuations at basal concentrations of messenger molecules, detection and extraction of events themselves, proper segmentation of neighboring events as well as tracking of propagating events. Moreover, event detection algorithms need to be sensitive enough to accurately capture localized and low amplitude events exhibiting a limited spatial extent.
This thesis presents three novel algorithms, PBasE, CoRoDe and KalEve, for the automated analysis of fluorescence events, developed to overcome the aforementioned challenges. The algorithms are integrated into a graphical application called MSparkles, specifically designed for the analysis of fluorescence signals, developed in MATLAB. The capabilities of the algorithms are demonstrated by analyzing astroglial Ca2+ events, recorded in anesthetized and awake mice, visualized using genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP3 as well as GCaMP5. The results were compared to those obtained by other software packages. In addition, the analysis of neuronal Na+ events recorded in acute brain slices using SBFI-AM serve to indicate the putatively broad application range of the presented algorithms. Finally, due to increasing evidence of the pivotal role of astrocytes in neurodegenerative diseases such as epilepsy, a metric to assess the synchronous occurrence of fluorescence events is introduced. In a proof-of-principle analysis, this metric is used to correlate astroglial Ca2+ events with EEG measurementsFluoreszenzfarbstoffe und genetisch kodierte Fluoreszenzindikatoren (GEFI) sind gängige Werkzeuge zur Visualisierung von Konzentrationsänderungen bestimmter Ionen und Botenmoleküle der intra- sowie interzellulären Kommunikation. Während Fluoreszenzfarbstoffe direkt in die Zielzellen eingebracht werden müssen und nur über einen begrenzten Zeitraum funktionieren, kann die Expression von GEFIs zell- und zeitspezifisch gesteuert werden, was darüber hinaus Langzeitanalysen in lebenden Organismen ermöglicht. Farbstoff- und GEFI-basierte Fluoreszenzfluktuationen, die mit Hilfe moderner bildgebender Verfahren aufgezeichnet werden, bilden die Grundlage für die Analyse physiologischer molekularer Kommunikation. Die Analyse einer großen Zahl komplexer Fluoreszenzsignale ist jedoch eine schwierige und zeitaufwändige Aufgabe. Eine automatisierte Analyse ist dagegen weniger zeitaufwändig und unabhängig von der Voreingenommenheit des Anwenders. Allerdings müssen hierzu mehrere Herausforderungen bewältigt werden. Unter anderem die korrekte Schätzung von Fluoreszenzschwankungen bei Basalkonzentrationen von Botenmolekülen, die Detektion und Extraktion von Signalen selbst, die korrekte Segmentierung benachbarter Signale sowie die Verfolgung sich ausbreitender Signale. Darüber hinaus müssen die Algorithmen zur Signalerkennung empfindlich genug sein, um lokalisierte Signale mit geringer Amplitude sowie begrenzter räumlicher Ausdehnung genau zu erfassen.
In dieser Arbeit werden drei neue Algorithmen, PBasE, CoRoDe und KalEve, für die automatische Extraktion und Analyse von Fluoreszenzsignalen vorgestellt, die entwickelt wurden, um die oben genannten Herausforderungen zu bewältigen. Die Algorithmen sind in eine grafische Anwendung namens MSparkles integriert, die speziell für die Analyse von Fluoreszenzsignalen entwickelt und in MATLAB implementiert wurde. Die Fähigkeiten der Algorithmen werden anhand der Analyse astroglialer Ca2+-Signale demonstriert, die in narkotisierten sowie wachen Mäusen aufgezeichnet und mit den genetisch kodierten Ca2+-Indikatoren (GECIs) GCaMP3 und GCaMP5 visualisiert wurden. Erlangte Ergebnisse werden anschließend mit denen anderer Softwarepakete verglichen. Darüber hinaus dient die Analyse neuronaler Na+-Signale, die in akuten Hirnschnitten mit SBFI-AM aufgezeichnet wurden, dazu, den breiten Anwendungsbereich der Algorithmen aufzuzeigen. Zu guter Letzt wird aufgrund der zunehmenden Indizien auf die zentrale Rolle von Astrozyten bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Epilepsie eine Metrik zur Bewertung des synchronen Auftretens fluoreszenter Signale eingeführt. In einer Proof-of-Principle-Analyse wird diese Metrik verwendet, um astrogliale Ca2+-Signale mit EEG-Messungen zu korrelieren
