Orientadora: Profa. Dra. Angelica B. W. BoldtCoorientador: Prof. Dr. Marcelo M. S. LimaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 30/10/2020Inclui referênciasResumo: Estima-se que o aumento na expectativa de vida resulte numa elevação de demências em 225% até 2050, principalmente doenças neurodegenerativas esporádicas em indivíduos com mais de 65 anos. Dentre estas, a doença de Alzheimer (DA) e doença de Parkinson (DP), correspondem às mais frequentes, e ainda carecem de cura e compreensão dos mecanismos e fatores etiológicos envolvidos. A DA apresenta acúmulo de placas B-amiloide (BA) e emaranhados neurofibrilares extracelulares (ENF), resultando na perda neuronal e atrofia cerebral, causando perda de memória e cognição. Já na DP ocorre a perda progressiva de neurônios dopaminérgicos da substância nigra pars compacta (SNpc) e das projeções do corpo estriado, além de inclusões citoplasmáticas de agregados de proteínas insolúveis (Corpos de Lewy), levando à rigidez muscular e alterações do movimento, com presença de tremor, e ocasionalmente quadros depressivos e demenciais. Logo, a investigação de fatores de risco nessas doenças, ampliando o conhecimento de sua etiologia e propondo novos alvos terapêuticos, é extremamente urgente. Com este objetivo, buscamos replicar na população sul-brasileira polimorfismos associados a DA em populações europeias. Também investigamos três polimorfismos sem relato prévio de associação, genotipando até 150 pacientes e 114 controles para 23 polimorfismos ao total (PCR-SSP e iPLEX MassARRAY). Para os polimorfismos associados, realizamos extensa investigação in silico para avaliar seu possível papel funcional. Adicionalmente, mensuramos o receptor 1 do complemento solúvel (sCR1) em plasma de pacientes e controles através de ensaio de imunoadsorbância ligada a enzima (ELISA). Para avaliar uma das vias da neuroinflamação, investigamos a presença de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) no plasma de pacientes e controles, através de ELISA. Também investigamos a regulação do gene Kynu (quinureninase da via das quinureninas) em até 22 ratos induzidos a DP, através de injeção de rotenona, e 18 ratos sham. Investigamos o padrão de metilação de dois sítios CpG (pirosequenciamento) e a expressão gênica de Kynu (RT-qPCR), correlacionando os dados obtidos com a análise do teste de reconhecimento de objeto (RDO), em grupos suplementados ou não, com ácido fólico e vitamina B12. Por meio dos resultados, evidenciou-se a importância da replicação de associações em diferentes populações, pois apenas quatro variantes de 20 permaneceram associadas na população sul-brasileira. A análise in silico mostrou que um dos polimorfismos avaliados, e oito variantes em desequilíbrio de ligação, encontram-se na sequência de seis longos RNA não codificadores, até então não associados a DA. Relatamos a primeira associação de polimorfismos de CR1 em uma população latino-americana, com o rs3849266 formando um haplótipo com rs2274567 (CA/CA), até então não investigado na DA, destacando a importância de análises haplotípicas com variantes em região regulatória. Pela primeira vez, evidenciamos a formação de NETs em pacientes sul-brasileiros de DA, discutindo a possibilidade de envolvimento do sistema complemento no recrutamento dos neutrófilos às placas. Por fim, evidenciamos que uma intervenção simples com suplementação de ácido fólico e vitamina B12 pode prevenir o comprometimento da memória causado pela rotenona no modelo de DP, podendo esta intervenção ser cogitada como uma terapia auxiliar para redução de sintomas em pacientes com DP.Abstract: It is estimated that the rise in life expectancy results in an increase in dementia by 225% until 2050, mainly sporadic neurodegenerative diseases in individuals over 65 years of age. Among these, Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD) correspond to the most frequent and still lack a cure and understanding of the mechanisms and etiological factors involved. AD presents an accumulation of B- amyloid plaques (BA) and extracellular neurofibrillary tangles (NFT), resulting in neuronal loss and cerebral atrophy, causing loss of memory and cognition. In PD, there is a progressive loss of dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (SNpc) and striatum projections, in addition to cytoplasmic inclusions of insoluble protein aggregates (Lewy bodies), leading to muscle stiffness and movement changes, presence of tremor, and occasionally depression and dementia. Therefore, investigating risk factors in these diseases, expanding the knowledge on their etiology, and proposing new therapeutic targets is extremely urgent. With this objective, we seek to replicate in the South Brazilian population polymorphisms associated with AD in European populations. We also investigated three polymorphisms with no previous association report, genotyping up to 150 patients, and 114 controls, totalizing 23 polymorphisms (PCR-SSP and iPLEX MassARRAY). For associated polymorphisms, we have carried out extensive in silico research to assess their possible functional role. Additionally, we measured the soluble complement receptor (sCR1) in patients and controls plasma using the enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA). To assess one of the pathways of neuroinflammation, we investigated the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) in the plasma of patients and controls, using ELISA. We also investigated the regulation of the Kynu gene (Kynureninase from the Kynurenine pathway) in up to 22 rats induced for PD through rotenone injection, and 18 sham rats. We investigated the methylation pattern of two CpG sites (pyrosequencing) and Kynu gene expression (RT-qPCR), correlating with the data obtained with the analysis of the Object Recognition Task test (ORT), in groups supplemented or not, with folic acid and vitamin B12. The importance of replicating associations in different populations became evident through the results, as only four variants of 20 were associated in the Southern Brazilian population. The in silico analysis showed that one of the evaluated polymorphisms, and eight variants in linkage disequilibrium, are found in the sequence of six long non-coding RNA genes, hitherto not associated with AD. We report the first association of CR1 polymorphisms in a Latin-American population, with rs3849266 forming an haplotype with rs2274567 (CA / CA), hitherto not investigated in AD, highlighting the importance of haplotypic analyzes with variants in regulatory regions. For the first time, we have evidenced the formation of NETs in Southern Brazilian patients with AD, raising the possibility of involvement of the complement system in the recruitment of neutrophils to plaques. Finally, we show that a simple intervention with folic acid and vitamin B12 supplementation can prevent memory impairment caused by rotenone in the PD model. This intervention can be considered a potential auxiliary therapy to reduce symptoms in PD patients
