Noxp20 et Noxp70, deux nouveaux marqueurs de la différenciation neuroectodermique précoce chez la souris

Abstract

During embryonic development and in adulthood, neuroectodermic differentiation is induced by multiple extrinsic and intrinsic signals that transform multipotential stem cells into differentiated cells (neurons or glial cells). During this process, pluripotent stem cells restrict their developmental competence and are committed to a particular differentiation pattern. In vitro differentiation models are needed to study and analyze the determination and differentiation mechanisms occurring in vivo. During this work, we used an in vitro neuroectodermic differentiation model developed by Odile Kellermann and colleagues. They immortalized F9 murine teratocarcinoma cells by transfecting a recombinant plasmid encoding the SV40 oncogenes. The immortalized F9 cells were then induced to differentiate with retinoic acid and the 1C11 neuroectodermic committed cell line was isolated. Upon appropriate induction, 1C11 determined cells acquire a neuronal phenotype, as well as the general functions of either serotoninergic or catecholaminergic neurons. In order to identify specific markers of neuroectodermic commitment and to determine genes and mechanisms involved in this early step of neurogenesis in vitro, we tried to point out genes expressed in 1C11 cells and not or weakly expressed in the F9 parental cell line. The RDA (Representational Difference Analysis) subtraction method allowed us to identify 105 different cDNA sequences representing 75 known genes, ESTs (Expressed Sequence Tags) or genomic fragments. Among the proteins encoded by known genes, we found proteins involved in cellular mechanisms governing nervous differentiation in vivo : migration, extracellular matrix composition or remodeling, adhesion, apoptosis, neuritogenesis, axonal guidance, synaptogenesis, The pattern of expression of the known genes expressed in 1C11 cells suggests that these cells correspond to embryonic days 8-10.5. In addition, we selected two RDA fragments showing identities with ESTs and we characterized the corresponding genes; we called them Noxp20 and Noxp70 (Nervous Overexpressed). Noxp20 protein, detected in the cytoplasm of murine NIH3T3 fibroblasts transfected with a vector containing the putative ORF of Noxp20, contains a CARD domain (Caspase Recruitment Domain). Experiments performed with transfected NIH3T3 cells showed that exogenous Noxp20 does not induce apoptosis. In situ hybridization analysis showed that Noxp20 is expressed in neuronal proliferation regions (ventricular and intermediate zones) of the brain and spinal cord at embryonic days 12 and 15, as well as in dividing regions of the adult brain (dentate gyrus, hippocampus, olfactory bulb). Noxp70 transcript encodes a small 15 kDa protein detected both in the cytoplasm and the nucleus of NIH3T3 cells transfected with a plasmid containing the putative Noxp70 ORF. This protein presents a CDGSH-type Zn finger domain. The function of this domain is still unknown, but zinc finger proteins are known to participate to nervous development, as transcription factors or as mediators of protein-protein interactions. The cerebral localization of Noxp70 in the telencephalic ventricular zone and in the thalamus and hypothalamus at embryonic day 15 suggests a role for Noxp70 in the early developing central nervous system. Noxp20 and Noxp70 are therefore new markers of a determined status before neuroectodermic differentiation. According to their pattern of expression, they could play an important role in brain development. This role remains to be determined.Durant le développement embryonnaire et la vie adulte, la différenciation neuroectodermique est induite par des signaux multiples extrinsèques et intrinsèques. Elle requiert la mise en oeuvre de mécanismes complexes, afin de mener des cellules souches multipotentielles à un état différencié (neurones ou cellules gliales). Au cours de ce processus, les cellules pluripotentes de départ restreignent leur compétence développementale. Elles s'engagent dans une voie de différenciation particulière et sont alors dites « déterminées ». La compréhension et l'analyse détaillée des phénomènes de détermination et de différenciation in vivo nécessite l'établissement de modèles d'étude in vitro. Au cours de ce travail, nous avons utilisé un modèle de différenciation neuroectodermique in vitro mis au point par le laboratoire d'Odile Kellermann au départ de cellules F9 de tératocarcinome murin, immortalisées à l'aide d'un plasmide porteur des oncogènes du virus SV40. Après induction, par l'acide rétinoïque, de la différenciation dans les cellules F9 immortalisées, l'équipe d'Odile Kellermann est parvenue à isoler une lignée de cellules déterminées neuroectodermiques (1C11). Soumises aux agents de différenciation adéquats, les cellules 1C11 sont capables d'acquérir un phénotype et une fonction catécholaminergique ou sérotoninergique. Le but de notre travail était d'identifier des marqueurs spécifiquement exprimés au moment de l'engagement dans la voie de différenciation neuroectodermique ainsi que des gènes et des mécanismes qui gouvernent cette étape précoce de la neurogenèse in vitro. A cette fin, nous avons recherché les gènes exprimés dans les cellules 1C11 et pas ou peu exprimés dans la lignée parentale F9. La technique d'hybridation soustractive RDA (Representational Difference Analysis) nous a permis de mettre en évidence 105 séquences différentes représentant 75 gènes connus, EST (Expressed Sequence Tags) ou fragments d'ADN génomique. Parmi les gènes connus, on retrouve des protéines impliquées dans des mécanismes cellulaires intervenant à différents niveaux de la différenciation nerveuse in vivo : migration, composition et remodelage de la matrice extracellulaire, adhésion, apoptose, neuritogenèse et guidance axonale, synaptogenèse, ... Le profil d'expression des gènes connus exprimés dans 1C11 suggère une correspondance entre ces cellules et des précurseurs neuroépithéliaux entre les JE 8 et 10.5. Nous avons également sélectionné deux fragments de RDA représentant des EST et nous avons caractérisé les gènes correspondants, que nous avons appelés Noxp20 et Noxp70 (Nervous System Overexpressed). La protéine Noxp20, détectée dans le cytoplasme de fibroblastes murins NIH3T3 transfectés avec un vecteur contenant l'ORF putative de Noxp20, contient un domaine CARD (Caspase Recruitment Domain). Des expériences réalisées dans des cellules NIH3T3 transfectées tendent à démontrer que Noxp20 exogène n'induit par l'apoptose. L'analyse de l'expression de Noxp20, par hybridation in situ, révèle sa présence dans les zones de prolifération neuronale (zones ventriculaire et intermédiaire) du cerveau et de la moelle épinière aux JE 12 et 15, ainsi que dans les régions en division du cerveau adulte (gyrus denté, hippocampe, bulbe olfactif). Le transcrit Noxp70 encode une petite protéine de 15kDa, que nous avons détectée dans le cytoplasme et le noyau de cellules NIH3T3 transfectées avec un plasmide contenant l'ORF putative de Noxp70. Cette protéine présente un domaine à doigt de zinc de type CDGSH dont la fonction reste à déterminer. Cependant, les protéines à doigt de zinc participent à différents processus biologiques, notamment au cours du développement nerveux, en tant que facteurs de transcription ou médiateurs des interactions protéine-protéine. La présence de l'ARNm de Noxp70 dans le cerveau, au niveau de la zone ventriculaire télencéphalique, du thalamus et de l'hypothalamus au JE 15 suggère un rôle de Noxp70 dans le développement précoce du SNC. Noxp20 et Noxp70 s'avèrent donc être deux nouveaux marqueurs de l'engagement dans la voie de différenciation neuroectodermique. Leur profil d'expression suggère qu'ils pourraient tous deux jouer un rôle important dans le développement cérébral. Ce rôle reste à déterminer...Thèse de doctorat en sciences biomédicales (biologie moléculaire du développement) (SBIM 3)--UCL, 200