Evaluation for the effect of seminal plasma reactive oxygen species on infertility during sperm dna fragmentation and apoptosis

Abstract

Spermatozoon DNA hasarının infertilitedeki önemi şimdiye kadar farklı mekanizmalarla birçok araştırmacı tarafından açıklanmaya çalışıldı. Bu mekanizmalardan protaminasyon, apopitoz ve oksidatif stres üzerinde duruldu. Sigaranın insanda semen kalitesini ve erkek faktörlü fertiliteyi ROS düzeyini arttırarak etkilediğine dair yayınlar bulunmakla birlikte sigara ile spermatozoon parametreleri arasında anlamlı ilişkinin saptanmadığı yayınlarda mevcuttur. Biz bu çalışmada sigara içimine bağlı olarak seminal plazma reaktif oksijen türlerinin, sperm DNA fragmantasyonu ve apopitozu sürecinde infertiliteye olan etkisinin değerlendirilmesini amaçladık. Sigara içen ve içmeyen 27 Astenozoospermia'lı, kontrol grubu olarak da sigara içen ve içmeyen 23 Normozoospermia'lı olmak üzere toplam 50 olgu çalışma kapsamına alındı. Bütün olgulardan toplanan semen örnekleri, makroskobik, mikroskobik, enzim aktivitesi ve morfometrik açıdan değerlendirildi. Reaktif oksijen türlerinin düzeyleri malondialdehit (MDA), antioksidanlardan Glutatyon peroksidaz (GPX) enzimi ve total protein miktarları ölçülerek belirlendi. Mikroskobik değerlendirmede sperm sayısı ve motilitesi WHO (Dünya Sağlık örgütü) kriterlerine göre, morfolojisi de Kruger'in kesin kriterlerine göre değerlendirildi. Eosin testi uygulanarak ışık mikroskobunda spermatozoon vitalitesi değerlendirildi. Her bir olgudan alınan semen örnekleri sırasıyla DNA fragmantasyonunu belirlemek için direkt TUNEL (TdT-mediated-dUTP nick end labeling) protokolü, apopitozu belirlemek için TUNEL pozitif oranının %10 ve üzeri olduğu olgularda Annexin V testi uygulandı. Ultrastrüktürel inceleme için transmisyon elektron mikroskobu kullanıldı. Çalışmamızda ROS düzeyinin yüksek bulunduğu astenozoospermia hasta grubunda spermatozoon DNA fragmantasyonu, kontrol grubundan daha fazlaydı. DNA fragmantasyonu ile semen parametreleri, vitalite arasında negatif korelasyon bulundu. Normozoospermia ve astenozoospermia olguları birbirleriyle karşılaştırıldığında sigaranın semen parametrelerine (konsantrasyon, motilite, morfoloji) etkisinin istatistiksel olarak anlamlı olmadığı saptandı. Sigara içen normozoospermia ve astenozoospermia olgularında içmeyenlere göre DNA fragmantasyonu daha yüksek olmakla birlikte istatistiksel açıdan anlamlı bulunmadı. Reaktif oksijen türeleri (ROS) ile semen parametreleri, vitalite gruplar arasında farklı olmakla birlikte istatistiksel açıdan ilişki bulunmadı. Ayrıca spermatozoon DNA fragmantasyonu ile apopitoz arasındaki pozitif korelasyon istatistiksel açıdan da anlamlıydı. Apopitoz ile ROS arasında doğrudan bir ilişki gösterilemedi. Sonuç olarak sigara içiciliği ile artan ROS düzeyinin apoptozisi indüklediğini ve dolayısıyla infertilitede doğrudan etkili olduğunu iddia eden çalışmaların aksine bu çalışmada sigara içiciliğinin ROS düzeyine etkisi istatistiksel olarak anlamlı bulunmamış apoptozis ve infertiliteye etkisi belirlenememiştir. İnfertillerde sigara içimiyle ROS'un doz bağımlı olarak arttığı bununda apoptozisten farklı bir mekanizma ile DNA fragmantasyonu oluşturduğu gösterilmiştir. The source for spermatozoon DNA damage and it's significance in infertility have been explained with various mechanisms by researchers so far. The emphasized subjects were protamination, apoptosis and oxidative stress. While there are papers submitting that smoking affects the semen quality in human, there are also papers which establish no significant relation between the parameters of smoking and spermatozoon. On this study, we intend to evaluate the effect of seminal plasma reactive oxygen species on infertility during sperm DNA fragmentation and apoptosis. Totally 50 cases were evaluated in the scope of the project. Semen samples were analyzed from twenty seven patients with asthenozoospermia and twenty three patients with normozoospermia (Smoking and non-smoking). Sperm concentration and motility rates were evaluated microscopically in accordance with World Health Organization (WHO) criterias while its morphology was assessed according to the Kruger's strict criterias by using STAT III stain. For vitality, Eosin Y assay applied to the semen samples and assessed with light microscopy. Semen samples were separated to three groups after each case. TUNEL assay was used to detect of DNA fragmentation, MDA assessment for ROS, GPX for antioxidant enzyme respectively. Annexin V assay used to determine apoptosis in TUNEL positive cases when apoptosis rate was >%10. Apoptosis was evaluated ultrastructurally by transmission electron microscopy. We saw that there is no significantly difference between smoking and semen parameters (concentration, motility, morphology) in cases with normozoospermia and asthenozoospermia . There was difference DNA fragmentation between asthenozoospermia and control group (normozoospermia). A negative correlation was found between DNA fragmentation and semen parameters, vitality. A significantly difference was found between the levels of MDA and GPX in two groups. MDA was no significant in spite of difference between smoking and non smoking groups. There was no significant difference between ROS and semen parameters, vitality in two groups. A positive correlation was found between ROS and DNA fragmentation. A negative correlation was found between ROS and GPX. These findings were supported by ultrastructurally. Consequently, on the contrary with papers claiming that ROS levels increased in smokers induce apoptosis and so directly affect the infertility, in this paper, the effect of smoking on ROS levels is not found statistically significant and so its effect on apoptosis and infertility is not established