张军

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·专家视点·戊型肝炎研究动态第 12届国际病毒性肝炎和肝病研讨会(巴黎)信息张　军(整理)　　作者单位:361005厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心　　第 12届国际病毒性肝炎和肝病研讨会 2006年7月 1日至 5日在法国巴黎召开。参加会议的有来自世界各地从事病毒性肝炎和肝病基础 、临床和预防控制研究的科研人员 、管理人员以及学生等约1000余人。大会由六个部分大会报告(28个报告)、30个部分分会报告(183 个报告)和 529 个墙报组成。会议摘要由“ Journal of Clinical Virology”杂志作为 2006 年第二期增刊出版 , 并发布于互联网(www .isvhld2006.com)。涉及戊型肝炎(戊肝)及戊型肝炎病毒(HEV)的有 3个大会报告 、4 个分会报告和 19个墙报。现将主要内容介绍如下 ,供我国相关科研 、临床和疾病预防控制工作者参考。一 、戊型肝炎研究历史回顾世界著名的肝炎病毒学家 、美国国立卫生研究院(NIH)过敏性和传染性疾病研究所(NIAID)的学者 Purcell博士回顾了戊肝研究的十大历史性突破 ,并提出了三大类尚未被回答的问题 。(一)十大历史性突破1.1955 ～ 1956年印度黄疸型肝炎的大爆发使人类首次认识到戊型肝炎的危害。2.80年代初前苏联 Balayan等利用志愿者及灵长类动物模型首先观察到了戊型肝炎病毒的电镜形态 ,证实该病毒是戊型肝炎的病原体。3.80 年代末 , 美国 Genelabs 公司克隆出了HEV 基因组部分片段并进而获得了全基因组序列 ,表达具有免疫学活性的重组抗原。4.Genelabs公司推出第一代戊肝血清学诊断试剂。5.广泛开展戊型肝炎血清流行病学 ,发现戊型肝炎是主要的肝炎之一 ,广泛流行于发展中国家。6.HEV 属戊型肝炎病毒科(Hepeviridae Fami-ly)戊型肝炎病毒属(Hepevirus Genus),可分为 5个基因型(Genotype), 1型和2型仅发现于人 ,3型和4型为人兽共患 ,5 型仅发现于禽类。能够感染人类的 1 ～ 4型 HEV 彼此能很好地交叉保护 ,表明仅有1个血清型 ,有利于疫苗的研制 。7.HEV宿主范围 、地理分布 、动物自然宿主研究提示动物自然宿主与人类戊肝有密切的联系 。8.美国 Emerson 等构建成功感染性 HEV cD-NA 克隆 ,为 HEV 病毒复制机制的研究奠定重要基础 。9.Emerson等最近成功筛选到一个肝癌细胞系 ,能支持HEV 感染性克隆的复制以及 HEV天然病毒的感染及复制 。10.昆虫细胞表达的和大肠杆菌表达的基因重组戊肝疫苗都已证实能对恒河猴提供良好保护 。葛兰素史克公司用昆虫细胞表达的重组戊肝疫苗在尼泊尔完成了 19个月的 II 期临床试验 ,结果表明保护率接近 100%。(二)未被回答的三大问题1 、戊肝血清学的反常戊肝的血清流行病学数据与一般的胃肠道传播病毒有较大的不同 。在许多戊肝危害最严重的国家如印度(戊肝约占急性肝炎的 50%),仅有不足 50%的自然人群戊肝抗体阳性 ,为甲肝抗体阳性率的一半;而另一些同样戊肝严重的国家如埃及 ,戊肝抗体阳性率约为印度的 2倍 ,接近于甲肝抗体阳性率;另外 ,在本土戊肝罕见的发达国家如美国 ,人群戊肝抗体阳性率不低于 5%,同时从环境中可以检出戊肝病毒。提示有某些重要的流行病学因素尚未被清楚认识。可能不同地区 HEV 基因型的差别是重要原因 。2 、HEV 分子生物学·97·国际病毒学杂志 2006年 8月第 13卷第 4期　Internat ional Journal of Virology , August 2006 , Vol 13 , No.4多种基于重组 DNA技术的戊肝候选疫苗仍处于研制阶段 。由于 HEV 感染性 cDNA克隆以及细胞感染模型的建立 ,戊肝抗病毒研究乃至减毒活疫苗研究将得到较大发展。3 、HEV 致病机制对HEV 致病机制的了解极少 。最近利用表达芯片在黑猩猩戊肝感染模型中的研究发现 HEV 感染宿主后引起的一系列基因表达的改变 。二 、重组戊型肝炎疫苗的 II期临床试验美国陆军医学研究所 R.Scot t博士报告了重组戊型肝炎疫苗 2001 年 7月 ～ 2003 年 12月在尼泊尔进行的 II 期临床试验的结果 。1.试验疫苗及免疫方案疫苗由葛兰素史克公司委托美国 Novavax公司生产 , 采用昆虫细胞 SF9 , 抗原表达区域为 HEVORF2的 aa112 ～ 607 ,抗原纯度>95%,经铝佐剂吸附。采用随机 、双盲 、安慰剂对照设计 ,疫苗组和安慰剂组各 1000 名易感者(尼泊尔军队“志愿者”)。试验组和对照组平均年龄分别为 28.0 和 31.3岁 ,每组各有 4名女性 。HEV 疫苗采用 20μg 剂量 ,接种程序为 0 、1 、6m 。2.随访方案所有接种者均要记录接种后 31d内的安全性数据 ,同时随机选取其中 10%由研究者进行接种后连续 8d的主动安全性观察。可疑病例的发现采用两条途径平行进行。一是每 2周主动随访研究对象 ,另一途径是每天查询医院入院记录 。绝大多数病例都是通过医院随访发现的 。3.诊断标准临床肝炎判断标准为:连续 3天以上的可疑肝炎临床表现 。对于符合临床肝炎标准的疑似病例 ,采集入院后 0w 、1w 、2w 和 4w 血清 ,并收集两次粪便。实验室检测:(1)肝功能;(2)甲肝 、乙肝 、丙肝感染指标;(3)HEV RT-PCR;(4)血清 HEV-IgM 定量和血清 HEV 总抗体(HEV-Ig)均采用利用疫苗抗原研制的定量 EIA 试剂。急性戊肝的确诊标准为:(1)临床表现和生化指标提示肝炎(ALT 高于正常上限的2.5倍以上 ,总胆红素高于 2mg dl);(2)血清和 或粪便的HEV RT-PCR阳性 ,并经HEV-IgM 或HEV-Ig EIA 证实(HEV-IgM 大于 100 WR U ml ,和 或HEV-Ig 大于 2500 WR U ml)。HEV-IgM 低于100 WR U ml ,HEV-Ig 低于 2500 WR U ml ,则诊断为“疑似戊肝” ;HEV-Ig 低于1000 WR U ml则排除“急性戊肝”。4.疫苗保护率自第一针接种后 14d 起 ,共观察到 83 例确诊“急性戊肝” ,24例“非戊肝”(甲肝 、乙肝和丙肝指标也阴性 , 10 例在疫苗组 , 14 例在安慰剂组)。共1794人完成了三次接种(疫苗组 896 人 ,安慰剂组898人),观察 804 天。自第三针后 1 月起 ,在安慰剂组共出现 66例急性戊肝病例 ,疫苗组出现 3例 ,疫苗发病保护率为 95.5%(95%可信限:85.6 ～98.6%)。5.疫苗免疫原性随机选择了 80 例疫苗组和 160例安慰剂组研究对象进行免疫原性观察。连续采集 0 、2 、6 、7 、24m血清 , 检测 HEV-Ig ,大于 20 WR U ml视为阳性。在疫苗组 , 2m 时抗体几何平均含量(GMC)为 77WR U ml(阳性率 81%), 6m 时为 31 WR U ml(阳性率48%), 7m 时为 248 WR U ml(阳性率 100%),24m时为 20 WR U ml(阳性率 56%)。6.疫苗安全性主动观察的对象中 ,疫苗组局部不良反应率为83%,安慰剂组为 68%, 差异具有显著性(p =0.03);疫苗组全身不良反应率为 71%,与安慰剂组的 75%差异没有统计意义 。由接种对象自动报告的不良反应中 ,疫苗组和安慰剂组局部不良反应率分别为 25.4%和 25.1%,差异没有统计意义。疫苗组的严重不良(SAE)发生率为 14.3%,显著低于安慰剂组的 20.0%(可由安慰剂组出现了大量急性戊肝患者而解释);疫苗相关的 SAE疫苗组为 0.4%,安慰剂组为 0.1%,差异无显著性。三 、戊型肝炎病毒细胞感染模型体系的建立及初步应用美国 NIAID的 Emerson博士报告了一个 HEV细胞感染模型的建立及初步应用 。用 HEV 感染性cDNA转染人肝癌细胞系 Huh-7的多个亚克隆 ,筛选到一个亚克隆(S10-3)具有较高的转染效率 ,并可在细胞内产生感染性 HEV 。 >90%的病毒仍与宿主细胞结合而并不扩散感染其他细胞。然而 ,细胞内病毒抽提物可以感染 10-3 细胞。利用该模型鉴定出一个与具有中和表位活性的 HEV ORF2 aa458～ 607重组蛋白特异结合的蛋白 HSC70 ,该蛋白为热休克蛋白 70(HSP70)家族成员 ,该蛋白虽然主要存在于细胞浆 ,但也分布于细胞膜 ,提示该蛋白可能通过结合 ORF2的 C 端而介导了 HEV 对宿主细胞·98· 国际病毒学杂志 2006年 8月第 13卷第 4期　Internat ional Journal of Virology , August 2006 , Vol 13 , No.4的侵入过程 。利用该模型还研究了 ORF3基因突变对细胞内病毒复制的影响 ,并检测了 HEV 抗体的中和活性 。四 、首例确证输血传播的戊肝病例报告英国国家血液中心 Boxall等报道了一起输血传播戊肝事件。1名男性 、43 岁 、已有 10 ～ 15年献血史的本地义务献血员 ,在献血后 14d出现身体不舒服 ,24d出现黄疸 ,ALT 2050 IU L。血液中心接到报告后立即停止了该份血液的应用 , 但在此前 , 4d时由该份血液制备的血小板已输入病人 1 ,18d由该份血液制备的浓缩红细胞输入病人 2。病人 1和病人2输血前 HEV 抗体均为阴性。输入的血液标本HEV-IgM 和 IgG 均为强阳性。对病人 1追踪检测至输血后 84d ,始终未出现感染症状 ,HEV IgM 、IgG和 RNA 均阴性。对病人 2 追踪检测至输血后132d ,结果:67d出现 AST 升高;74d HEV IgM 阳性 ,但 HEV IgG 始终阴性(可能与该病人持续化疗导致免疫低下有关);34d ～ 89d HEV RNA 阳性 ,且序列与献血员一致 ,均为基因 3型;病人 2急性肝炎表现轻微 。据了解 , 这是世界上首次直接证实的HEV 经输血传播事件 ,提示即使在 HEV 低流行的发达国家 ,也需要进一步评估 HEV 引起输血后肝炎的危害性;在 HEV 高流行区 ,这一危害性还远未被认知。五 、戊肝流行病学我国李荣成等报道了对广西 8个县 7284 人进行的 1年戊肝血清流行病学随访结果。人群 HEV抗体阳性率从 25.2%到 66.1%不等 ,平均 43.5%。在 60岁前 ,人群抗体阳性率随年龄累积明显 ,60岁以上基本呈平台 ,提示 HEV 已在该地区稳定存在约60年。HEV 年新感染率为 4.3%(95%可信限:3.4%～ 5.3%),抗体自然阴转率为 1.4%(95%可信限:0.9%～ 2.1%);新感染率最高的年龄段为 25～ 29岁(11.8%,95%可信限:6.1%～ 20.2%)。在30岁前 ,男性和女性的感染率基本相同 ,但 30岁后男性感染率显著高于女性 。在随访期间从该地区分离到 24株 HEV ,其中 23株为 HEV 基因 4 型 ,另 1株为基因 1型。阿根廷 Munne 等报道 ,在 35例原因不明儿童重症肝炎中 ,有 3 例 HEV RNA 阳性 ,均为基因 3型。法国学者 Pavio 等报道在三个商品猪群中都分离到了 HEV 基因 3型 ,同一群内的病毒基因组同源性较高 ,而不同群间有一定差异 。另外 ,从 1例本地戊肝患者饲养的宠物猪血清中分离到 HEV基因3型病毒 ,其序列与病人体内分离到的 HEV 基因序列同源性为 91%。巴西Santos等报道 ,巴西商品猪中 ,7d龄以下戊肝抗体阳性率为 100%, 2 ～ 8w 龄阳性率逐渐下降 ,随后迅速上升 ,在 25w 龄以上阳性率达 97.3%。从猪粪便 、血清和污水中均检出 HEV RNA ,但在粪便 、血清中的 HEV RNA 为基因 3型 ,而污水中检出的 HEV为基因 1 型 ,提示人 、猪 HEV 共处于同一环境之中。印度Kumar等报告在印度北方全年采集的 121份污水标本中 , 36 份 HEV RNA 阳性(阳性率29.8%)。阳性标本分布于各个时间段 ,冬季(11月～ 2 月)阳性率 40%, 夏季(3 月 ～ 6 月)阳性率37%,雨季(7月 ～ 10月)阳性率 20%。全部病毒均为 HEV 基因 1 型 , 未检出 HEV 基因 3 、4 型。Arankalle等报道在印度西部 38例 HEV RNA阳性散发戊肝患者中 ,均为基因 1型 。六 、戊肝致病机制研究美国 CDC的 Kraw czynski对 HEV 的致病机制和感染自然史做了综述 。HEV 在感染复制期由肝细胞释放进入胆汁和血清 。肝内的 HEV 抗原水平在血清抗体阳转时急剧下降 。在戊肝病人中 , IgM和 IgG抗体在起病时通常就能检出。抗 HEV IgM抗体应答发生于ALT 高峰前 ,紧接着就是 IgG 抗体应答 ,抗体含量持续升高至恢复期。在灵长类感染模型中 , IgM 抗体水平急剧下降 ,而在 10 年后 IgG抗体仍可维持较高滴度;ALT 开始升高和肝组织病理学改变与血清抗体阳转和肝细胞内 HEV 抗原水平下降同时发生。戊肝病人的淋巴细胞增殖检测结果提示细胞免疫参与了 HEV 感染的致病过程。在病人和灵长类感染模型中观察到的 HEV 免疫应答与病变发生之间的时间关系提示 HEV感染中的肝脏病理改变更可能是免疫介导的 ,而非 HEV 的直接细胞致病效应。最近利用基因芯片进行的研究发现了 HEV病毒复制期以及 HEV 特异性免疫应答过程中宿主细胞某些基因表达的上调也许可以进一步解释病毒-宿主相互作用的动态过程。对肝癌细胞系中 HEV ORF3蛋白表达引起的细胞内信号转导的研究提示了该蛋白在感染细胞存活或促进细胞毒性 T 细胞(CTL)介导的感染肝细胞的破坏中的作用。德国 Banas等报道了一例免疫抑制患者(肾移·99·国际病毒学杂志 2006年 8月第 13卷第 4期　Internat ional Journal of Virology , August 2006 , Vol 13 , No.4植后)长达 3年以上的慢性戊肝。该患者 2001 年 1月接受了肾移植手术并持续进行免疫抑制治疗 ,2003年 9月起血清 ALT 持续异常 ,肝脏病理学检测发现病毒性肝炎特征。回顾性检测发现该患者2002年 9 月起血清 HEV PCR持续阳性 、抗 HEVIgM 弱阳性直至 2003年 7月;2003年 12月血清抗HEV IgM 、IgG 阳性 、血清 HEV PCR继续阳性 、粪便HEV PCR 阳性直至 2005 年 12月(末次检测 ,HEV PCR 已持续 39 月阳性)。在该病例中可见HEV 感染并持续复制 1年后才出现在肝功能损伤 ,与免疫应答发生时间重叠 ,提示戊肝致病机制中免疫应答的重要作用 。前述英国报道的输血后戊肝病例病情轻微 ,该病例由于长期化疗同样处于免疫低下状态 ,也提示了戊肝病程中的免疫致病机制的重要性。此外 ,印度 Srivastava 等报告了戊肝病例的天然免疫情况 ,发现虽然病人外周血 NK 细胞 、NK-T细胞的数量较健康人有所减少 ,但 NK 细胞毒性并无差别 ,提示天然免疫在机体清除 HEV 过程中的作用不大。·综述·乙型肝炎病毒变异及其意义黄雁翔综述　陈新月 李卓审校【摘要】　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus ,HBV)在其慢性感染过程中 , 可以发生基因变异。引起变异的原因 ,一是由 HBV 自身分子生物学的特性决定 ,二是由宿主的特异性免疫应答及抗病毒药物选择所致。HBV 变异可引起对宿主的影响 ,特别是对 HBV 感染的自然过程 , 病毒的清除及抗病毒药物反应等产生影响。近年国内外有关乙型肝炎病毒的研究成果不断涌现 , 现将乙型肝炎病毒变异及其意义做一综述。【关键词】　乙肝病毒;基因;变异　　作者单位:100069 首都医科大学附属北京佑安医院　　HBV 基因组是一个大约 3200 个碱基的部分双链环形 DNA ,其负链核苷酸序列有 4个开放读码框(open reading f rame , ORF), S , P , C , X 基因区 。HBV有很高的复制率 ,其复制由前基因组 RNA 中间体反转录为负链 DNA ,反转录是利用病毒本身的DNA聚合酶 ,此酶缺乏校对活性 ,可造成复制过程中反转录失真。HBV 变异率高于其他 DNA病毒约4个数量级。HBV 变异广泛存在于基因组的不同部位 ,变异可单独存在于某个基因区 ,亦可同时出现在几个基因区 。因此一个宿主可以感染许多相似株。HBV感染时 ,比较单一的病毒株易于呈自限性经过;而呈相似株分布的感染将可能使感染慢性化 。一 、S 区基因变异S 区基因包括 S基因 、前 S1和前 S2基因 ,含有3个翻译起始密码和一个共同的终止密码 ,主要编码 HBV 的包膜蛋白。(一)S 基因变异S基因位于HBV基因组核苷酸(nucleotide ,nt)156 ～ 833之间 ,编码含有 226个氨基酸(amino acid ,aa)残基的主蛋白 ,即 HBsAg 。HBsAg 是 HBV 包膜蛋白的主要组成部分 ,带有 T 、B 细胞表位 ,可诱导人类产生保护性抗体应答 。HBsAg 有 2个亲水区 ,分别位于 aa29 ～ aa79 和 aa99 ～ aa168之间 ,其中第二个亲水区尤为重要 ,称为主亲水区(major hydro-philic reg ion ,MHR),它是一个暴露的区域 ,是中和抗体和诊断抗体应用的主要靶位。HBsAg 的免疫显性表位“ a”位于 aa124 ～ 147 之间 , 正处于 MHR内 , a为包膜蛋白型的决定簇 ,也是所有 HBsAg 亚型的共同决定簇。针对该决定簇的抗体对所有具有a决定簇的亚型的 HBV 感染 ,可提供保护性免疫 。S 基因的变异主要发生在亲水区 。S 基因nt587G※A ,使第 145位由甘氨酸(GGA)变为精氨酸(AGA);aa145 位的甘氨酸还可变为丙氨酸。·100· 国际病毒学杂志 2006年 8月第 13卷第 4期　Internat ional Journal of Virology , August 2006 , Vol 13 , No.4

戊型肝炎研究动态第12届国际病毒性肝炎和肝病研讨会(巴黎)信息

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