目的建立维生素b4片溶出度检测方法。方法采用桨法,以900 M l P H6.8磷酸盐缓冲溶液为溶出介质,温度37.0℃,转速为50 r/MIn,选取时间为45 MIn,经0.45μM微孔滤膜过滤,取续滤液,采用紫外分光光度法测定维生素b4片的溶出量,检测波长为262 nM,溶出限度为标示量的80%。结果维生素b4浓度在4~16μg/M l范围内与吸光度呈良好的线性关系,r=0.9999(n=5),平均回收率为100.1%,rSd=1.0%(n=9)。结论该方法简便、灵敏、准确,对不同生产企业的处方、工艺有一定考察作用,可用于维生素b4片的溶出度测定。Objective To establish a test method for determining the vitamin B4 tablets dissolution.Methods Paddle method was used to 900 m L p H6.8 phosphate buffer solution as the dissolution medium,the temperature of 37 ℃,the speed of 50 r/min,take time for 45 min.Taking the filtrate through the 0.45 μm microporous membrane filtration,vitamin B4 tablets dissolution quantity determined by ultraviolet spectrophotometry,determined the wavelength of 262 nm,dissolution limit for 80% of the labeled amount.Results Vitamin B4 concentration had a good linear relationship with the absorbance in 4 ~ 16 μg/m L,r = 0.9999( n = 5),the average recovery was 100.1%,RSD = 1.0%( n = 9).Conclusion The method is simple,sensitive and accurate,has certain effect on prescription and study of the process of different production enterprises,can be used for the dissolution determination of vitamin B4 tablets

李彩霞

林惠武

林燕琼

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维生素 B4 片溶出度方法学研究林燕琼1，李彩霞1，林惠武2Δ( 1. 厦门大学附属第一医院 药学部，福建 厦门 361003; 2. 厦门大学附属第一医院思明分院 药学部，福建 厦门 361000)［摘要］ 目的 建立维生素 B4 片溶出度检测方法。方法 采用桨法，以 900 mL pH6. 8 磷酸盐缓冲溶液为溶出介质，温度37. 0 ℃，转速为 50 r /min，选取时间为 45 min，经 0. 45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，采用紫外分光光度法测定维生素 B4 片的溶出量，检测波长为 262 nm，溶出限度为标示量的 80%。结果 维生素 B4 浓度在 4 ～ 16 μg /mL 范围内与吸光度呈良好的线性关系，r =0. 9999( n = 5) ，平均回收率为 100. 1%，ＲSD = 1. 0% ( n = 9)。结论 该方法简便、灵敏、准确，对不同生产企业的处方、工艺有一定考察作用，可用于维生素 B4 片的溶出度测定。［关键词］ 维生素 B4 片; 溶出度; 紫外分光光度法［中图分类号］ Ｒ927. 2 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005 － 1678( 2015) 06 － 0147 － 04Study on dissolution method of Vitamin B4 tabletsLIN Yan-qiong1，LI Cai-xia1，LIN Hui-wu2Δ( 1. Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China; 2. Department ofPharmacy，Siming Branch of the First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361000，China)［Abstract］ Objective To establish a test method for determining the vitamin B4 tablets dissolution. Methods Paddle method was used to 900 mLpH6. 8 phosphate buffer solution as the dissolution medium，the temperature of 37 ℃，the speed of 50 r /min，take time for 45 min. Taking the filtratethrough the 0. 45 μm microporous membrane filtration，vitamin B4 tablets dissolution quantity determined by ultraviolet spectrophotometry，determinedthe wavelength of 262 nm，dissolution limit for 80% of the labeled amount. Ｒesults Vitamin B4 concentration had a good linear relationship with theabsorbance in 4 ～ 16 μg /mL，r = 0. 9999 ( n = 5 ) ，the average recovery was 100. 1%，ＲSD = 1. 0% ( n = 9 ) . Conclusion The method is simple，sensitive and accurate，has certain effect on prescription and study of the process of different production enterprises，can be used for the dissolutiondetermination of vitamin B4 tablets.［Keywords］ Vitamin B4 tablets; dissolution; UV spectrophotometry作者简介: 林燕琼，女，大专，副主任药师，研究方向: 医院药学，E-mail:doctorlinyq@ 163． com; 林惠武，通讯作者，男，本科，副主任药师，研究方向: 临床药学，E-mail: fjxmlhw361@ 163． com。维生素 B4 片又名磷酸氨基嘌呤，可以作为 ＲNA 和 DNA 的组成物质应用于蛋白质生物合成的过程中，主要用于预防治疗各种原因引起的白细胞减少症、急性粒细胞减少症［1］。其为高溶解性、高渗透性药物，分子结构式见图 1。图 1 维生素 B4 片结构式Fig. 1 Vitamin B4 structural formula其生物药剂分类系统属于 BCSⅠ类药物［3］。对于 BCSⅠ类药物制剂，以 0. 1 mol /L 盐酸溶液为介质，在适当的溶出度试验条件下，15 min 的溶出量大于 85%时，可认为药物的生物利用度不受溶出行为的控制，即制剂的行为与溶液相似。在这种情况下，胃排空速度是药物吸收的限速步骤。如果药物溶出比胃排空时间慢，需要在多种介质中测定溶出曲线，在禁食状态下，胃内滞留( 排空) T50% 时间为 15 ～ 20 min。该品种为 2015 年版《中国药典》标准提高品种，原标准只采用崩解时限检查［2］，无法考察不同生产企业的处方、工艺的优劣，本文根据其生物学及药剂学特性，通过对其溶出度特性的研究，建立了溶出度检测方法。1 材料与方法1. 1 药品与试剂 维生素 B4 片原料药( 货号 3507，天津市天厂家) ; 维生素 B4 片购自 5 家生产企业，各 3 批，货号分别为:生产企业 A( 3501 ～ 3503 ) 、B ( 3504 ～ 3506 ) 、C ( 3508 ～ 3510 ) 、D( 3517 ～ 3519) 、E( 3541 ～ 3543) ; 其他试剂均为分析纯。1. 2 仪器 ＲCZ-8M 溶出试验仪( 购自大天发科技有限公司) ，UV-2600 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 ( 购 自 日 本 岛 津 公 司 ) ，METTLEＲ TOLODO SG2 型酸度计( 购自德国梅勒特公司) 。1. 3 方法 分别选用 0. 1 mol /L 盐酸溶液( 取 9 mL 浓盐酸加蒸馏水稀释至 1000 mL) 、pH 4. 5 的醋酸盐缓冲溶液 ( 取醋酸—741—中国生化药物杂志 2015 年第 6 期 总第 35 卷 生化药物技术钠( 三水合物) 2. 99 g 加水溶解，加入 2 mol /L 醋酸溶液 14. 0 mL，加水稀释至 1000 mL) 、pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液( 取 0. 2 mol /L磷酸二氢钾溶液 250 mL，加 0. 2 mol /L 氢氧化钠溶液 118 mL，用水稀释至 1000 mL) 和水( 脱气) 4 种溶出介质［4］，转速 50 r /min，温度 37. 0 ℃的条件下，取样时间分别为 5、15、30、45、60、75 min取样，取样 5 mL，同时相应地补充溶液 5 mL，照紫外分光光度法在( 262 ± 2) nm 下测定吸光度［5］，另取维生素 B4 原料药适量，用相应的溶出介质溶解并稀释为 11 μg /mL 的磷酸腺嘌呤溶液，作为对照溶液。1. 4 溶解度及稳定性研究 取磷酸腺嘌呤( 维生素 B4) 原料药各约 1 g，用 4 种溶出介质溶解并稀释至 25 mL，并置 37. 0 ℃的水浴中 1 h，并不断振摇制成过饱和溶液。再取原料药 11 mg，用相应的溶出介质溶解并稀释为每 1 mL 含 11 μg 的磷酸腺嘌呤溶液，作为对照溶液，测定并计算过饱和溶液的溶解量，即为该物质的在溶出介质中的溶解度。1. 5 溶出曲线测定 取 A 厂家 3501 批、B 厂家 3504 批、C厂家 3508 批、D 厂家 3517 批、E 厂家 3541 批样品各 6 片，分别于上述 4 种溶出介质中按照 1. 3 项下的方法测定。1. 6 建立的溶出方法 取本品，按照溶出度测定法 ( 中国药典 2010 年版二部附录ⅩC 第 二 法 ) ［5］，以 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液( pH 6. 8) 900 mL 为溶出介质，转速为 50 r /min，依法操作，经45 min 时，取溶液适量，滤过，精密量取续滤液适量，用溶出介质定量稀释制成约含 11 μg /mL 的溶液，照紫外-可见分光光度法( 中国药典 2010 年版二部附录Ⅳ A) ［6］，在 262 nm 波长处分别测定吸光度; 另取本品 10 片，精密称定，研细，精密称取适量( 相当于平均片重) ，用溶出介质定量稀释制成约含 11 μg /mL 的溶液，滤 过，取 续 滤 液，同 法 测 定，计 算 每 片 的 溶 出 量。限 度为 80. 0%。1. 7 方法学验证［7］1. 7. 1 辅料干扰: 通过将淀粉、糊精、微晶纤维素、硬脂酸镁、羧甲淀粉钠、蔗糖按不同比例混合制备混合辅料，平均每片制剂所含的辅料量按 0. 09 g 计算。取 1 片辅料量按 1. 6 项下溶出方法进行操作，经 0. 45 μm 的滤膜过滤，并在 220 ～ 300 nm 波长范围内扫描。1. 7. 2 滤膜吸附试验: 选用 C 厂家( 编号 3517 ) 的溶出溶液，采用离心( 经 4000 r /min，离心 5 min) 、过滤( 经 0. 45 μm 的滤膜) 方式，对离心溶液、初滤液及续滤液进行检测。1. 7. 3 试验方法准确度考察( 以回收率表示) : 精密称定原料药( 编号 3507) 约 5、8、10 mg，按浓度 50%、80%、100% 各平行称取 3 份，分别置 1000 mL 量瓶中，再分别加入混合辅料 ( 相当于 1 片制剂的量) 约 0. 09 g，用 pH 6. 8 磷酸盐缓冲溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。经 0. 45 μm 滤膜过滤，取滤液在 262 nm 波长处测定吸收度。1. 7. 4 线性与范围: 精密称取原料药 0. 01348 g 至 100 mL量瓶中，加入 pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液溶解、定容、摇匀; 用刻度吸管精密移取上述溶液 3、2、3、5、3 mL 分别至 25、25、50、100、100 mL 量瓶中，用 pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液定容、摇匀，所得溶液浓度依次为 16. 176、10. 784、8. 088、6. 740、4. 044 μg /mL; 照紫外光度测定法在 262 nm 波长处测定吸光度。1. 7. 5 溶出溶液稳定性考察: 选用 C 厂家( 编号 3517) 的样品按 1. 3 项下方法操作，经 45、75、105、165 min 取样，并经 0. 45μm 滤膜过滤，取滤液在 262 nm 波长处测定吸收度。1. 7. 6 精密度试验: 精密称定 VB4 原料药约 10 mg，平行称取 6 份分别至 100 mL 量瓶中，用 pH 6. 8 磷酸盐缓冲溶液溶解、定容、摇匀。再精密移取 5 mL 至 50 mL 量瓶中，用 pH 6. 8 磷酸盐缓冲溶液定容、摇匀。在 262 nm 波长处测定吸收度。2 结果2. 1 辅料干扰 辅料在 261 nm 波长处几乎无吸收，吸光值平均为 0. 0037( n = 5) 。故辅料对溶出度测定基本无干扰。2. 2 滤膜吸附试验 初滤液与离心溶液比较，吸光度下降了 1. 3%，续滤液与初滤液比较，吸光度未发生变化。说明经0. 45 μm 的滤膜过滤，滤膜对样品有吸附作用，滤膜吸附约为1. 2%，溶出量减少 0. 03%，在允许的限度范围内。2. 3 准 确 度 考 察 维 生 素 B4 片 溶 出 度 的 平 均 回 收 率100. 1% ( n = 9) ，ＲSD = 1. 05%，见表 1。表 1 回收率试验结果Tab. 1 Ｒesults of recovery test原料药称样量对照( g)辅料加入量( g)吸收值A回收率( % )平均回收率( % )ＲSD( % )0． 00560 0． 09077 0． 3194 99． 20． 00489 0． 09004 0． 2786 99． 10． 00501 0． 09044 0． 2830 98． 30． 00841 0． 09050 0． 4863 100． 60． 00831 0． 09020 0． 4844 101． 40． 00870 0． 09011 0． 5039 100． 80． 00998 0． 09082 0． 5752 100． 30． 01047 0． 09080 0． 6021 100． 10． 01018 0． 09147 0． 5924 101． 2100． 1 1． 052. 4 维生素 B4 片的溶解度及稳定性研究 维生素 B4 片的溶解度及稳定性研究结果见表 2。维生素 B4 片在 0. 1 mol /L的盐酸溶液中溶解度最高，为 20. 3 mg /mL，稳定时间为 20 h。表 2 维生素 B4 片在不同介质中的溶解度及稳定性Tab. 2 Solubility and stability of Vitamin B4 tablets in different medium溶出介质溶解度( 37. 0 ℃，mg /mL)稳定性( 37. 0 ℃ )0. 1 mol /L 的盐酸溶液 20. 3 20 h 内稳定pH4. 5 的醋酸盐缓冲溶液 13. 4 6 h 内稳定pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液 10. 3 6 h 内稳定水 8. 1 20 h 内稳定2. 5 5 家生产企业分别在不同溶出介质中的溶出曲线 5家生产企业分别在不同溶出介质中的溶出曲线见图 2。—841—生化药物技术 中国生化药物杂志 2015 年第 6 期 总第 35 卷图 2 5 家生产企业分别在 4 种溶出介质中的溶出曲线图比较Fig. 2 Comparison of the dissolution curves of 5 production enterprises infour kinds of dissolution medium2. 6 溶出介质的选择 维生素 B4 片是速溶制剂，5 家生产企业在 0. 1 mol /L 盐酸溶液中溶出比较快，5 min 样品溶出量已达到 85%以上，无法对生产企业的不同处方、工艺的进行区分; pH 4. 5 的醋酸盐缓冲溶液、pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液及水，3 种的溶出速率较缓慢，但水无酸碱缓冲能力，对于处方中所产生的酸碱度无法进行控制，故选用 pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液较好，能避免制剂对溶出介质酸碱度的干扰。在 pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液 溶 出 介 质 中，有 4 家 生 产 企 业 的 样 品 在 溶 出 时 间30 min，样品的溶出量均达到了 80%，故溶出时间设定为 45 min。同一溶出介质不同生产企业的溶出曲线见图 3。图 3 同一溶出介质中不同生产企业的溶出曲线图比较Fig. 3 Comparison of dissolution curves of different production enterprises inthe same dissolution medium2. 7 线性与范围 磷酸腺嘌呤浓度在 4 ～ 16 μg /mL 的范围内呈良好的线性关系，相关系数为 1，线性方程为 y = 0. 0574C +0. 0025( n = 5，C 为 μg /mL) 。2. 8 溶出溶液稳定性考察和仪器精密度试验 样品在45 min 内稳定。溶液吸收系数 ＲSD 为 0. 29%，表明仪器的精密度良好。2. 9 验证试验 5 家生产企业共 15 批样品按照 2. 6 方法测定，仅有 1 批测定结果低于限度 80%，其余 14 批达到限度要求，测定结果见表 3。表 3 溶出度测定结果Tab. 3 Ｒesults of dissolution determination生产企业 编号 溶出度( % )A 厂家 3501 114、111、108、110、105、1113502 101、108、100、101、105、1023503 107、108、107、105、111、111B 厂家 3504 83、88、83、86、93、863505 89、93、85、92、102、943506 91、92、97、90、99、98C 厂家 3508 100、102、102、102、100、1023509 98、101、98、99、98、993510 103、105、101、104、103、100D 厂家 3517 63、68、84、58、71、64、59、60、68、62、72、773518 102、102、100、100、99、1043519 100、99、98、100、99、99F 厂家 3541 100、100、92、98、102、1023542 98、98、98、100、94、1003543 98、107、100、103、104、1033 讨论维生素 B4 属于生物分类系统 BCSⅠ类药物，其体内吸收性能与溶出度方法已无相关性［8］，建立体外溶出度方法的重要目的是能够保证药品批间质量的一致性。选择释放介质的一个重要标准是漏槽条件［9］，漏槽条件是指药物所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，生理学解释为药物在体内被迅速吸收，制剂的体外包括释放度等测定需要模仿体内生理条件的、满足药物溶解、吸收的过程，漏槽条件起到了修正作用。因此测定药物在不同介质中的溶解度可以初步拟定其制剂的释放介，故选择 pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液作为体外溶出介质。在 pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液中维生素 B4 片的溶出速率较缓慢，对处方工艺有一定区分度，并避免由于片剂本身处方工艺中辅料对溶出介质的酸碱度干扰［10］。实验结果显示 D 厂家的 3517 批样品在 45 min 时未达到标示量的 80%，但该厂家其余 2 批 ( 批号 3518、3519 ) 达到溶出限度，由此可猜测 D 厂家对其生产工艺进行了调整，由此可看出选择 pH 6. 8 的磷酸盐缓冲溶液作为溶出介质对于维生素 B4 片的体外溶出度测定达到了有效的质量一致性考察目的。( 下转第 153 页)—941—中国生化药物杂志 2015 年第 6 期 总第 35 卷 生化药物技术表 1 纯度验证试验结果Tab. 1 Validation test results of purity优化工艺纯度( % )1 2 3 4 51 99. 046 98. 924 98. 984 99. 143 99. 2062 99. 0784 99. 354 99. 144 99. 412 99. 1433 99. 877 99. 543 99. 921 99. 661 99. 492表 2 回收率验证试验结果Tab. 2 Validation test results of recovery优化工艺回收率( % )1 2 3 4 51 44. 00 41. 35 45. 64 46. 25 43. 662 42. 69 43. 57 45. 63 45. 92 44. 383 40. 66 42. 47 43. 55 41. 66 44. 873 讨论根据上述 8 种组合工艺实验以及优化的 3 种工艺实验，本研究认为: 三氯甲烷和乙醚萃取、冰乙酸沉淀对去除第三峰对应杂质均有效，且冰乙酸沉淀和三氯甲烷萃取共用效果更好，但不能完全去除第三峰; 实验没有用水和冰乙酸及有机溶剂除杂，则纯度较低。实验没有用灰柱除杂，则纯度较低。实验水洗少，或酸洗少，或过灰柱少，则纯度较低。按照组合工艺所分离葛根素的纯度达到 99% 以上，其回收率在 42% ～45%，虽然回收率较高，但仍需要进一步研究以提高收率; 组合工艺的步骤太繁琐，需要进一步优化工艺过程，以降低成本，节省时间; 粉煤灰的处理方法及其脱色机理有待进一步的研究; 连续水洗 5 次后样品颜色变暗，其原因不详，需进一步研究探讨。各方法有机结合在一起能够更有效的提纯葛根素，使葛根素的纯度超过 99%，回收率在 42% ～45%，比张仲景现代中药有限公司的回收率( 12% ～18% ) 高出 27% ～30%。因此本研究确定的最佳工艺可行。可使葛根素纯度超过 99%，回收率达 40%以上。参考文献［1］ 潘见，戴郁青，袁传勋 . 葛根素配位萃取探讨［J］. 合肥工业大学学报( 自然科学版) ，2002，25( 5) : 650-653.［2］ 刘永录，赵引娣，杨会池 . 葛根保健作用的化学及药理基础研究近况［J］. 河北中医，2008，30( 4) : 435-437.［3］ 范礼理，赵德华，赵敏琦，等 . 葛根黄酮抗心律失常作用［J］. 药学学报，1985，20( 4) : 647．［4］ Ｒong H，Stevens JF. 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Study on dissolution method of Vitamin B4 tablets

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