人角质细胞生长因子(kErATInOCyTE grOWTH fACTOr,kgf)在组织的损伤修复中起着重要的作用.植物细胞生物反应器是一种成本低、安全性好的蛋白生产系统.本研究将人kgf-1经农杆菌介导法转入水稻中,共获得38株抗性再生植株.SOuTHErn杂交和rT-PCr结果表明kgf-1基因整合入水稻基因组中且部分转化株中kgf-1基因得到转录.WESTErn blOTTIng检测结果显示有两株转化水稻中能够表达kgf-1.Keratinocyte growth factor(KGF) plays an important role in the tissue damage repair.Plant cell bioreactor is a low cost and safe protein production system.Human KGF-1 gene was transformed into rice by Agrobacterium-mediated method and a total of 38 putative transgenic rice plants were obainted.The results of southern blotting and RT-PCR assay showed that KGF-1 gene was integrated into the rice genome and KGF-1 gene was transcribed in part of the putative transformed rices.Western blotting results showed that KGF-1 was expressed in two transgenic rices.福建省自然科学基金资助项目(2010J01240

张国广

沈明山

苏勇波

陈亮

Xiamen University Institutional Repository

2010 年第 3 期                           漳州师范学院学报(自然科学版)                           No. 3. 2010 年 （总第 69 期）                  Journal of Zhangzhou Normal University（Nat. Sci.）                General No. 69  文章编号:1008-7826(2010)03-0097-04 人角质细胞生长因子-1 在水稻中的表达  张国广 1, 2，苏勇波 1，沈明山 1，陈 亮 1 * （1. 厦门大学 生命科学学院, 福建 厦门 361005; 2. 漳州师范学院 生物系, 福建 漳州 363000） 摘  要：人角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor, KGF）在组织的损伤修复中起着重要的作用.植物细胞生物反应器是一种成本低、安全性好的蛋白生产系统.本研究将人 KGF-1 经农杆菌介导法转入水稻中，共获得 38 株抗性再生植株.Southern 杂交和 RT-PCR 结果表明 KGF-1 基因整合入水稻基因组中且部分转化株中KGF-1 基因得到转录.Western blotting 检测结果显示有两株转化水稻中能够表达 KGF-1. 关键词：角质细胞生长因子 ；水稻遗传转化 ；基因表达 中图分类号：         Q 78          文献标识码：          A  Recombinant Keratinocyte Growth Factor-1 Expression in Rice ZHANG Guo-guang1, 2 , SU Yong-bo1 , SHEN Ming-shan1 , CHEN Liang1  (1. School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen, Fujian, 361005, China; 2. Biology department, Zhangzhou Normal University, Zhangzhou, Fujian 363000, China) Abstract: Keratinocyte growth factor (KGF) plays an important role in the tissue damage repair. Plant cell bioreactor is a low cost and safe protein production system. Human KGF-1 gene was transformed into rice by Agrobacterium-mediated method and a total of 38 putative transgenic rice plants were obainted. The results of southern blotting and RT-PCR assay showed that KGF-1 gene was integrated into the rice genome and KGF-1 gene was transcribed in part of the putative transformed rices. Western blotting results showed that KGF-1 was expressed in two transgenic rices.  Key words: keratinocyte growth factor-1 ; rice genetic transformation ; gene expression 1  引言 角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor, KGF）是成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors, FGFs）超家族中的成员，目前在人类组织中分离到两种角质细胞生长因子，KGF-1（亦称成 FGF-7）和KGF-2（亦称成 FGF-10)，两种蛋白因子间具有 57%的同源性[1].研究表明两种细胞因子具有很多重要的生物学功能，参与并调控多种组织和器官的形成和分化[2,3]，同时在组织的损伤修复中发挥着重要的作用[4,5]，因此 KGF 作为一种新型多肽类药物具有广阔的应用前景.目前 KGF 多是来源于异源细胞表达，如原核细胞[6-8]，酵母细胞[9]等，来源于植物细胞表达的较为少见.植物细胞作为生物反应器生产重组蛋白具有成本廉价、保存运输方便、免疫原性好、安全等诸多优点[10].本研究将人 KGF-1 基因导入水稻中，获得了表达人 KGF-1基因的转基因水稻. 2  材料与方法 2.1 材料 农杆菌菌株：携带植物表达载体 pBI1301-KGF 的 EHA105 菌株[11]保存于厦门大学细胞生物学实验室；                                                        收稿日期: 2010-06-05 基金项目: 福建省自然科学基金资助项目(2010J01240) 作者简介: 张国广(1973-), 男, 讲师. *通讯作者：陈  亮, 男, 教授. E-mail:chenlg@xmu.edu.cn 98                                  漳州师范学院学报（自然科学版）                                 2010 年  植物材料：水稻品种中华 11(Oryza sativa L)幼胚由福建省农科院水稻研究所提供.试剂：所用药品和抗生素等购自上海生工；工具酶购自大连宝生物公司；引物由上海英骏生物公司合成；KGF 抗体购自武汉博士德生物工程有限公司.培养基的配制：诱导培养基 MS+2, 4-D 2 mg/L；继代培养基 MS+2, 4-D 2 mg/L；共培养培养基 MS+2, 4-D 4 mg/L+AS(乙酰丁香酮)；筛选培养基 NB+2, 4-D 2 mg/L+Cb(头孢菌素) 500 mg/L+Hyg (潮霉素) 100 mg/L；预分化培养基 NB+ABA 2 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 1 mg/L + Cb 250 mg/L+Hyg 25 mg/L；分化培养基 NB+6-BA 3 mg/L+NAA 1 mg/L+Cb 250 mg/L+Hyg 25 mg/L. 2.2 方法 2.2.1 水稻幼胚的愈伤组织诱导 取中华 11 幼胚，70%酒精灭菌 1 min，10%的次氯酸钠表面消毒 45 min；无菌水清洗 3~5 遍，用解剖针剥出幼胚盾片，接种于诱导培养基中.在 25~26℃，暗培养的条件下，幼胚一般 4 d 后会长出芽，用镊子将芽从基部掐出，将剩余的颗粒状的愈伤接种至新的诱导培养基中，2 周后，会长出直径约 0. 5~1. 0 cm、淡黄色、半松散状颗粒愈伤，可用作下一步的遗传转化. 2.2.2 根癌农杆菌介导的水稻转化 用接种环从保存的农杆菌菌种中取样并划卡那霉素抗性平板，28℃培养 2-3 d 后，挑取活化的农杆单菌落接种于 50 ml 含卡那霉素的 LB 培养基中，培养至对数生长期，离心收集农杆菌并重悬于适量的共培养液体培养基中，将 1.2.1 制备的愈伤组织立即浸人以农杆菌悬浮液，于摇床中缓慢摇动 15 min 后，将愈伤组织块从菌液中取出，置于无菌滤纸上吸干，而后移入共培养培养基中. 共培养 2-3 d 后，再把愈伤组织块移到筛选培养基上，2 周继代一次，继代 2 次. 2.2.3 预分化、分化及抗性植株再生 挑选直径 1-2 mm 生长良好、结构致密的抗性愈伤组织转移入预分化培养基中，25 ℃，12 h 光照培养，预分化时间一般为 2 周.将预分化后的抗性愈伤组织转移至分化培养基上进行分化培养，6-8 周后再生出小苗，再生小苗在 1/2 MS 培养基上培养两周后，移栽到土里. 2.2.4 转基因植株的 PCR 检测 PCR 鉴定正向引物 5′-GGCGGATCCTCTAGAATGGCTTGCAATGACATGACTCCA-3′; 反向引物5′-GAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3′.扩增 KGF 全长约 500 bp 大小的片段.PCR 反应程序为：94  ℃4 min；94  45 s℃ ，50  45 s℃ ，72  50 s℃ ，35 个循环；72℃，8 min.PCR 结束后 1%凝胶电泳检测目的条带. 2.2.5 点杂交和 RT-PCR 检测 点杂交中 DNA 探针采用 KGF 基因，标记采用地高辛标记，方法参照 Bio-Rad 公司 Dig High Prime DNA Labeling and Dection Starter Kit І试剂盒操作，实验步骤参照文献[12].抗性再生植株总 RNA 的提取和 RNA的反转录采用大连宝生物试剂盒，按照试剂盒步骤操作，以反转录获得的 cDNA 为模板，2.2.4 所述引物和条件进行检测. 2.2.6 GUS 及 Western blotting 检测 再生植株的叶片，放入 X-Gluc 液中，37℃下放置过夜，无水乙醇脱色，呈蓝色的为 GUS 阳性[10].转基因水稻蛋白提取采用丙酮沉淀法，蛋白浓度的测定采用上海生工试剂盒（SK3041），取 20-50 μg 蛋白样品进行 SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白电转移至尼龙膜，以兔抗 KGF 蛋白抗体为第一抗体，以辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔 IgG 为第二抗体，进行 Western blotting 分析，采用 ECL 方法曝光、显影，操作步骤参考文献[12]. 3  结果 3.1 转 KGF 抗性植株的获得 图 1 水稻抗性植株第 3 期                  张国广，苏勇波，沈明山，陈 亮：人角质细胞生长因子-1 在水稻中的表达                99  转移到筛选培养基中的愈伤经过 2 周的筛选培养后，愈伤褐化，继代一次再经过约 2 周，部分褐化的组织上长出淡乳白色，略透明，生长相对旺盛的抗性愈伤.抗性愈伤在筛选培养基中长大至直径为 5 mm 时移至预分化培养基中，一般 1 周后可以看到愈伤上有绿点产生，预分化培养基培养 2 周后转移至分化培养基中，在分化培养基中 2 周后，每个愈伤一般能长出 1～4 棵小苗（图 1），转化实验共获得 38 株抗性植株. 3.2 抗性再生植株的 PCR 检测 以抗性再生水稻总 DNA 为模板进行 PCR 扩增，未转化植株 DNA 为阴性对照模板，部分抗性株 KA3、KA4、KA5、KA6、KA8 检测出现 500 bp 左右的目的带，与阳性对照（质粒）大小一致，阴性对照没有出现相应的带（图 2）.38 株抗性再生植株中 20 株 PCR 检测为阳性. 3.3 抗性再生植株的 GUS 检测 部分再生植株的叶片和根经组织化学染色后，可观察到明显的蓝色，说明 GUS 基因在转基因植株中稳定表达（图 3）.检测的 38株再生植株中，有 17 株 GUS 检测为阳性.      A                                                                        B 图 3 GUS 基因在水稻再生植株中稳定表达 A、 GUS 基因在水稻再生植株叶片中稳定表达；B、GUS 基因在水稻再生植株根中稳定表达       3. 4 斑点杂交检测 取部分转基因植株的叶片提取总 DNA，进行斑点杂交. 结果显示部分再生植株的 DNA 与地高辛标记的探针结合，在底片的显影中呈现黑色斑点（图 4），进一步证实了 KGF基因已经整合入部分水稻基因组中. 3.5 RT-PCR 检测 图 2 抗性植株的 PCR 检测结果 1、未转化的再生植株；2~10、抗性再生植株（编号KA1~KA9）；11、空白对照；12、阳性对照；M、DL2 000 DNA marker 图 5 部分水稻再生植株的 RT-PCR 检测结果  1、阴性对照；2～5、转化再生植株编号 KA3、KA4、KA5、KA6；6、DL 2 000 DNA maker 图 4 部分水稻再生植株的斑点杂交检测结果 1～7 转化再生植株编号 KA1、KA3、KA4、KA5、KA6、KA8、KA11; 8 未转化的再生植株；9 阳性对照（质粒 pMD18T-KGF） 图 6 水稻再生植株的 western blotting 检测结果 1-4、分别为抗性植株 KA3、KA4、KA5 和KA6；5、未转化植株 100                                  漳州师范学院学报（自然科学版）                                 2010 年  提取部分抗性再生植株的总 RNA，经反转录反应合成 cDNA， cDNA 作为反应模板，部分转化植株扩增出长度约为 500 bp 的清晰条带，而阴性对照（未转化植株 cDNA）没有相应的扩增条带（图 5），说明目的基因已在部分转化植株中正常转录.                                             3.6 Western blotting 检测 取四株 KA3、KA4、KA5、KA6 转基因水稻中的总蛋白 SDS-PAGE 电泳后转膜，用 KGF 抗体进行 western blotting 分析，显影后观察到其中两株转基因水稻（KA4 和 KA6）中出现大小约为 19 Ku 的杂交信号（图6），与预期表达蛋白 KGF-1 的大小相同，未转化植株并没有相应杂交信号出现，western blotting 结果表明KGF-1 基因在 KA4 和 KA6 两株水稻中得以有效表达.                          4  讨论 利用转基因植物生产药用蛋白具有其独特的优势，因其具有真核表达系统多肽翻译后的糖基化、磷酸化等正确的修饰和加工能力，且生产成本低，在获得高效表达的转基因植株后，通过增加种植面积，就能获得大量的药用蛋白.目前利用植物表达系统表达的有抗体[13]、疫苗[14]和药用蛋白[15]等，部分已经推出商业化产品.以往的研究中多数是将 KGF 基因在原核细胞和酵母细胞中[6-9]表达，本研究将人 KGF-1 基因通过农杆菌介导法转化水稻，获得 38 株抗性植株，通过 western blotting 获得了 2 株能够表达 KGF-1 蛋白的转基因水稻，本研究为进一步深入 KGF 的功能研究以及基因工程重组药物开发奠定了基础.   参考文献： [1] Igarashi M, Finch PW, Aaronson SA. 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Recombinant Keratinocyte Growth Factor-1 Expression in Rice

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/119011/%e4%ba%ba%e8%a7%92%e8%b4%a8%e7%bb%86%e8%83%9e%e7%94%9f%e9%95%bf%e5%9b%a0%e5%ad%90-1%e5%9c%a8%e6%b0%b4%e7%a8%bb%e4%b8%ad%e7%9a%84%e8%a1%a8%e8%be%be.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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