本文提出在金基底上用阳离子聚电解质———聚二烯丙基二甲基胺氯化物 (poly(dial lyldimethylammoniumchloride) ,PDDA)自组装膜固定长链DNA的方法 ,用DiffuseReflectanceIn frared ,XPS和STM技术进行表征 ,并对DNA杂交进行电化学标

包烨

吴玲玲

周剑章

林仲华

林种玉

董丽琴

董平

颜佳伟

Xiamen University Institutional Repository

第 7 卷  第 3 期2001 年 8 月电化学ELECTROCHEMISTRYVol. 7  No. 3Aug. 2001文章编号: 1006_3471( 2001) 03_0276_05长链 DNA 在金基底上的固定化和电化学标记周剑章,吴玲玲,董丽琴,林种玉,颜佳伟,董  平,包  烨,林仲华*(厦门大学固体表面物理化学国家重点实验室,化学系, 物理化学研究所,福建 厦门  361005)摘要:  本文提出在金基底上用阳离子聚电解质 ) ) ) 聚二烯丙基二甲基胺氯化物 ( poly ( dia-lly ldimethylammonium chloride) , PDDA)自组装膜固定长链 DNA 的方法, 用 Diffuse Reflectance In-frared, XPS 和 STM 技术进行表征, 并对 DNA 杂交进行电化学标记.关键词:  聚电解质; DNA固定化; 电化学标记; STM ; FT_IR , XPS中图分类号:  O 646       文献标识码:  A随着人类基因组计划的顺利实施, 基于 DNA探针的基因传感器、基因芯片的研究正成为基因组研究的一个热点[ 1~ 4] .无论是在基因传感器和芯片研究中,还是在其他诸如 DNA 与药物小分子的相互作用研究中, DNA在基底上的固定化都是一个令人感兴趣的课题. 要构筑基因传感器、基因芯片,首先必须先将 DNA 探针固定到固体表面, 才能通过杂交反应检测其互补片段.而基因芯片的 DNA 固定化方式主要有片上就位合成和微量点样两大类.利用就位合成法可以制作较高密度的基因芯片,但目前只能处理长度小于 25个碱基的寡聚核苷酸. 微量点样法用于制作中等密度的芯片, 它的优点是不仅可处理寡聚核苷酸,也可处理链较长的 cD-NA[ 5, 6] .但寡聚核苷酸点阵芯片( ONA)的发展较 cDNA 点阵芯片( CDA)更为成熟, 主要体现在芯片制作( DNA固定化)的技术方面. 探索构筑高密度、低成本的基因芯片的技术始终是研究者感兴趣的课题. 从发展 CDA 芯片的角度讲,研究长链 DNA 的固定化方法具有相当实际的意义.我们认为采用分子自组装技术将 DNA固定于基底(如金)上并进一步用于制作高密度的基因芯片是一条值得开发的途径. 本文探索了采用分子自组装技术固定化 DNA 于金基底上的方法,采用谱学和电化学方法进行了表征, STM 实验表明自组装膜具有一定的有序性,随之固定其上的 DNA也顺着这个结构进行吸附.当前基因芯片主要采用的是荧光标记的检测方法.根据一些电活性分子与 ssDNA 和 dsD-NA相互作用以及引起的电化学反应存在明显的差异, 我们研究组一直致力于利用这种差异发展 DNA杂交的电化学标记方法[ 7]. 研究电标记的杂交检测方式将开辟另外一条制作更方收稿日期: 2001- 03- 10* 通讯联系人基金项目: 国家自然科学基金( 29803007)、教育部科学技术研究重点项目( 99177)和教育部博士点基金资助项目.便更廉价的基因芯片的途径.1  实  验实验用 PDDA购自 Sigma, 小牛胸腺 DNA( CT DNA)购自北京华美公司( OD260/ OD280>1. 8, 105~ 107Dalton) ,硫堇购自上海化学试剂公司, 使用前未经进一步纯化. 其他试剂均为分 图 1  dsDNA/ PDDA/ Au ( a) 和 ssDNA/ PD-DA/ Au 的红外漫反射谱图 Fig . 1  Diffuse r eflectance infrared spectr a ofdsDNA/ PDDA/ Au ( a ) and ssDNA-PDDA/ Au( b)析纯. DNA溶液采用 Tris-HCl( 5 mmol/ L Tris, 50mmol/ L NaCl, pH7. 3)配制,浓度由紫外吸收光谱分析标定. ssDNA 由天然 CT DNA 热变性得到.Dif fuse Reflectance FT- IR 试验采用 Nicolet 740 光谱仪. XPS 试验采用 VG ESCA-LAB MK-II 型光谱仪,激发光源为 Mg KA line( 50 eV) . STM 实验使用DI公司的 Nanoscope I IIa,以单晶Au( 111) (根据文献[ 8]制作)为基底. 吸光度由岛津 UV-2100 紫外可见光谱仪测得.电化学实验使用 CHI 660A 电化学工作站,电化学电解槽采用三电极体系, 工作电极为金修饰电极, 辅助电极为铂电极, 参比电极为饱和甘汞电极, 实验前通氮气除氧 20 min. 实验用超纯水来自 Millipore Mill-i Q( 18 M 8)系统.2  结果与讨论 图 2  PDDA( a) , dsDNA/ PDDA( b)和 ssDNA/ PD-DA( c)在金上的 XPS P2p 谱图 Fig. 2 T he P2p XPS spectr a of PDDA/ Au( a)、dsD-NA/ PDDA/ Au ( b) and ssDNA / PDDA/ Au( c)2. 1  DNA 在金电极上的固定化实验用金电极依次用 3. 5 L、1. 5 L、0. 5 L和0. 05 L氧化铝粉末抛光, 经浓硫酸处理 5min后,分别用丙酮、乙醇, 和超纯水超声清洗10 m in.将上述的金电极浸泡在 1% 的 PDDA溶液中 30~ 60 min 进行 PDDA 分子自组装,取出后用超纯水清洗, 再浸入 DNA 溶液于 4e 下经历 12~ 24 h以固定化 DNA分子, 最后用超纯水清洗备用.2. 2  Diffuse Reflectance FT-IR 与  XPS表征  图1示出dsDNA/ PDDA和 ssDNA/ PDDA膜的 Diffuse Ref lectance FT- IR 谱图, 图中 1240 cm- 1与 1 084 cm- 1处的峰可分别归属于DNA链上磷酸基团反对称的和对称的伸缩振#277#第 3 期        周剑章等: 长链 NDA 在金基底上的固定化和电化学标记图 3a  PDDA 自组装膜的 STM 图象Fig . 3a  STM images of PDDA sel-f assembling filmson Au( 111) , 100 @ 100 nm, current mode,Z- range: 0. 58 nA, setpoint: 0. 88 nA ,Vbias: 0. 20 V图 3b  DNA/ PDDA的 STM 图象F ig. 3b  STM images of DNA/ PDDA films on Au(111 ) , 100 @ 100 nm, current mode, Z-range: 1. 57 nm, setpo int: 0. 20 nA,Vbias: 0. 28 V动, 1 666 cm- 1处的峰则对应于 DNA碱基中双键的伸缩振动[ 9].据图可见, dsDNA和 ssDNA两者的图相近. 图 2a、b、c分别是 PDDA、dsDNA/ PDDA和 ssDNA/ PDDA的 XPS P2p谱. 如图可知, 无论是 dsDNA/ PDDA 抑或 ssDNA/ PDDA 表面都有大量的 P 元素存在, 而 PDDA膜的表面却是没有 P 元素的. 这就证明了 DNA在 PDDA膜表面上的吸附.2. 3  STM 表征图3a是 PDDA自组装膜 STM 图象,由图可见, 表面的 PDDA 呈现二维有序的线条状排列.而其后接着固定于PDDA 膜上的DNA是顺着 PDDA的线条状结构进行吸附的(见图 3b) .由于长链 DNA具有容易弯曲折绕的特点,因而我们认为在 ST M 图中所观察到的一些凸出的岛状结构当为 DNA 长链上一些未被吸附的片段缠绕聚集的结果,这同 HOPG电极上观察到的长链 DNA的 STM 图象相吻合[ 10] .2. 4  DNA 杂交的电化学标记图 4a, b, c, d是[ Co ( phen) 3 ]3+ / 2+分别在裸金、PDDA/ Au、dsDNA/ PDDA/ Au 和 ssDNA/PDDA/ Au电极上氧化还原反应的 CV 曲线. 如图可知, 金电极表面自组装上 PDDA 膜后[ Co( phen) 3]3+ / 2+ 的氧化还原电流峰大降低.这是由于电极表面修饰的 PDDA 聚阳离子阻碍了[ Co ( phen) 3 ]3+ / 2+的氧化还原. 对 dsDNA/ PDDA/ Au 电极则在一定的电位范围内,[ Co( phen) 3]3+ / 2+ 氧化反应的峰电流 I pa与扫描速度 T成正比, 而在 ssDNA/ PDDA/ Au电极上[ Co( phen) 3]3+ / 2+ 的 I pa 与 T1/ 2 或 T 均 不成正 比. 这说 明对 dsDNA/ PDDA/ Au 电极#278# 电  化  学                   2001 年图 4  [ Co( phen) 3] 3+ / 2+ 在不同电极上的循环伏安图Fig . 4  Cyclic voltammograms of [ Co ( phen) 3 ] 3+ / 2+ ( 50Lmol/ L ) at ( a) bare Au electrode, ( b) PDDA/Au, ( c) ssDNA/ PDDA/ Au, ( d) dsDNA/ PDDA/Au, 5 mmol/ L pH 7. 3 T r is-HCL buffer contain-ing 50 mmol/ L NaCl, scan rate: 100 mV/ s图 5 吸附硫堇在 DNA/ PDDA 电极上的微分脉冲伏安图Fig . 5  Differential pulse voltammograms of t hion-ine before ( a) and after ( b) DNA hy-br idizat ion at DNA / PDDA/ Au electrodes[ Co( phen) 3]3+ / 2+在其上的反应是个表面过程,而在 ssDNA/ PDDA/ Au电极上, 则是混合控制的过程. [ Co( phen) 3]3+ / 2+在 dsDNA/ PDDA/ Au与 ssDNA/ PDDA/ Au电极上伏安图的氧化还原峰电位及峰电流的差异也表明[ Co ( phen) 3]3+ / 2+与 ssDNA 和 dsDNA 的相互作用方式不同.文献报道,在一定的离子强度( > 40 mmol/ L)下, [ Co( phen) 3]3+ / 2+ 与 dsDNA的相互作用主要是嵌入模式,而与 ssDNA的相互作用则比较复杂[ 11] , 这同我们的实验结果是相符合的.据此, 可以利用[ Co( phen) 3]3+ / 2+ 与 ssDNA 和 dsDNA 在指定电位下氧化还原反应电流值的差异来检测 DNA杂交与否, 即对 DNA杂交进行电化学标记.我们还研究了吩噻嗪衍生物硫堇与 DNA 相互作用后的氧化还原行为, 图 5 为杂交前后DNA/ PDDA/Au电极上吸咐的硫堇的微分脉冲伏安曲线, 从图中可见, 杂交后 DNA/ PDDA/Au电极上硫堇的电流峰明显下降.因而利用硫堇在杂交前后的不同电化学响应,有可能将硫堇作为检测 DNA杂交的标记物.#279#第 3 期        周剑章等: 长链 NDA 在金基底上的固定化和电化学标记Immobilizat ion of Long-Strand DNA onto Gold Surfaceand Elect rochemical Labeling of Hybridizat ion of DNAZHOU Jian-zhang, WU Ling- ling, DONG L-i qin, LIN Zhong-yu,YAN Jia-wei, DONG Ping, BAO Yue, LIN Zhong-hua( S tate K ey Lab. f or Phys. Chem . of the Sol id Surf ace, Dep t . of Chem . ,Inst . of Phys. Chem . , Xiamen Univ . , X iamen 361005, China)Abstract: Poly( diallyldimethy lammonium chloride) ( PDDA) w as used to facilitate long-st randDNA immobilizat ion onto gold surface using sel-f assembly method. Characterizat ion of the PDDAsel-f assembled f ilm and subsequently immobilized DNA were carried out by Diffuse ReflectanceInfrared, XPS, ST M and elect rochemical measurements. Hybridization of DNA was labeled byelect rochemical method.Key words: Poly elect rolyte, Immobilizat ion, Elect rochemical labeling, STM, FT-IR, XPSReferences:[ 1]  Boncheva M , Schibler L, Linco ln P , et al. Design o f oligonucleotide ar rays at inter faces [ J] . L angmuir,1999, 15: 4 317.[ 2]  Thompson M , Furtado L M . High density oligonucleo tide DNA probe arrays for the analysis at tar get DNA[ J] . Analyst, 1999, 124: 1 133.[ 3]  Taton T A , M irkin C A , Letsinger R L . Scanometric DNA array detection wit h nanoparticle probes[ J] . 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长链DNA在金基底上的固定化和电化学标记

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