以不同的受体选择性视黄素处理乳腺癌细胞，通过荧光显微术、ＴｄＴ测定和细胞生长测定，分析视黄素诱导的癌细胞凋亡及其对癌细胞生长抑制的相互关系；将受体ＲＡＲα基因转染乳腺癌ＭＢ－２３１细胞，发现受体转染与细胞凋亡诱导有关；ＲＡＲ和ＲＸＲ受体选择性视黄素联合使用，对诱导癌细胞凋亡和抑制癌细胞生长具有加强作用．结果证实，视黄素能够诱导乳腺癌细胞的细胞凋亡，并与抑制癌细胞的恶性生长相一致，这可能是视黄素抗癌作用的机制之一

吴乔

张晓坤

郑耘

Xiamen University Institutional Repository

第 37 卷　第 2 期 厦门大学学报(自然科学版) Vo l. 37　No . 2　1998年 3月 Journal of Xiamen Univ er sity ( Natural Science) Mar . 1998　视黄素诱导的癌细胞凋亡及其对癌细胞生长抑制的相关性¹吴　乔　郑　耘　张晓坤º(厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室暨国家教委开放研究实验室　厦门　361005)摘要　以不同的受体选择性视黄素处理乳腺癌细胞, 通过荧光显微术、TdT 测定和细胞生长测定, 分析视黄素诱导的癌细胞凋亡及其对癌细胞生长抑制的相互关系;将受体 RARA基因转染乳腺癌 MB-231 细胞, 发现受体转染与细胞凋亡诱导有关; RAR 和 RXR 受体选择性视黄素联合使用, 对诱导癌细胞凋亡和抑制癌细胞生长具有加强作用. 结果证实,视黄素能够诱导乳腺癌细胞的细胞凋亡, 并与抑制癌细胞的恶性生长相一致, 这可能是视黄素抗癌作用的机制之一.关键词　受体选择性视黄素, 细胞凋亡,生长抑制, 乳腺癌细胞中国图书分类号　Q 753, Q 228细胞凋亡( Apoptosis)是细胞生理性死亡的主要形式, 它作为一种主动的自杀途径而限制细胞的数量[ 1, 2].细胞凋亡不同于细胞坏死( N ecrisis) ,前者表现为细胞收缩,细胞膜皱褶,染色质凝聚和DNA 断裂等特征, 而后者则是在细胞受到严重的理化刺激及生物感染后发生的, 表现为细胞肿大胀裂,胞内物质溢出等现象[ 3] .研究已表明,细胞凋亡在维持生物体的正常发育、组织形成、机体平衡、以及对生理感染和其它细胞损伤的应答中具有重要作用 [ 4] .视黄素( ret inoid)在调节细胞生长、分化和发育过程中扮演重要的角色[ 5～7],广泛用于上皮癌和早幼粒白血病的治疗,已显示出一定的防癌、治癌作用[ 5～7] . 有关研究表明, 视黄素能够诱导许多类型癌细胞的细胞凋亡[ 8, 9] ,这可能是视黄素抑制癌细胞生长的一个重要机制.视黄素的作用主要由其受体 视黄酸受体( RARs)和视黄素 X受体( RXRs)介导[ 10],本文以不同的受体选择性视黄素( RAR-select ive retinoids 和 RXR-select iv e ret inoids)处理乳腺癌细胞,分析视黄素诱导癌细胞凋亡和对癌细胞生长抑制的相互关系; 将受体 RARA基因转染癌细胞,以阐明受体在细胞凋亡中的作用; 另外, RAR-和 RXR-受体选择性视黄素联合使用,将对诱导癌细胞凋亡和抑制癌细胞生长产生加强作用.1　材料和方法1. 1　细胞培养和药物处理乳腺癌 ZR-75-1和MB-231细胞(来自美国 ATCC)分别用 RPMI-1640和DMEM 培养液培养, 细胞接种 24 h 后,加入视黄素(由美国加州 SRI International Inc. M enol Park 提供)处¹º 美国加州 La Jolla 癌症研究中心,本室兼职研究员本文 1997-04-21收到; 　福建省自然科学基金资助项目理细胞.各种视黄素或两种视黄素合用( 1∶1)的终浓度均为 10- 6mol/ L .1. 2　荧光显微镜观察细胞核形态细胞经视黄素处理 4 d,胰酶消化, PBS 缓冲液( pH7. 5)收集,离心后用 3. 7%多聚甲醛固定 1 h,于 DAPI( 4, 6-Diam idino-2-phenylindole, 0. 1 Lg / ml )溶液中避光染色 1 h, 最后细胞涂片,荧光显微镜下观察细胞核形态的变化,并在同一张片上随机观察 1 000 个细胞, 统计细胞凋亡数量.1. 3　T dT ( t erminal deox yribonucleotidyl transf erase) 测定细胞经视黄素处理 4 d, 胰酶消化, PBS 缓冲液收集,离心后用 3. 7%多聚甲醛固定 1 h,生物素-16-dUT P 标记细胞,用荧光标记的抗生物素蛋白的异硫氰酸盐染色(按产品说明书操作,试剂盒购于 Boehringer , M annheim, Germany) ,最后在流式细胞仪上自动分析细胞凋亡百分率.1. 4　细胞生长测定以 1 000个细胞/孔的数量将细胞接种于 96孔培养板中, 24 h 后加入不同的视黄素处理细胞, 每隔 3 d更换一次新鲜培养液和加入视黄素, 8 d 后以 MTT ( 3-[ 4, 5-Dime-thylthiazol-2-yl ] -2, 5-diphenyltet razolium brom ide)染色法(按产品说明书操作, 试剂盒购于 Promega,M adison, WI)测定细胞生长率.2　结　果2. 1　细胞凋亡的形态学观察细胞发生细胞凋亡,主要变化在细胞核形态和 DNA 结构上. 经全反式视黄酸 t-RA 诱导后,发生细胞凋亡的细胞,细胞核变小,染色体固缩, 并断裂成许多小片段,形成致密的小体,经荧光剂 DAPI染色后,呈发亮小体(图版Ⅱ) ,与对照组细胞核形态(图版 I)存在显著差别.用其它不同的受体选择性视黄素诱导癌细胞,也有这种典型的细胞凋亡形态变化(图版略) ,表明视黄素能够诱导乳腺癌细胞的细胞凋亡.2. 2　不同的受体选择性视黄素诱导的细胞凋亡用不同的受体选择性视黄素诱导乳腺癌细胞, 同样看到细胞凋亡现象. 统计表明,不同的视黄素诱导细胞凋亡的能力不同.图 1显示, 在激素依赖性( hormone-dependent )乳腺癌 ZR-75-1细胞中, t-RA 和 RAR受体选择性视黄素能够有效地诱导细胞凋亡, 其中 11286的诱导能力最强, 达到 22% ;而 RXR 受体选择性视黄素则不能显著诱导 ZR-75-1 细胞的细胞凋亡.相反,在激素非依赖性( ho rmone-independent )乳腺癌 MB- 231细胞中, RXR受体选择性视黄素诱导细胞凋亡的能力显著提高,最高达到 15% ; RA R受体选择性视黄素虽然也有诱导作用,但效果显著低于对 ZR-75-1细胞的诱导.表明不同的视黄素都具有一定的诱导能力,但对不同细胞的诱导能力有所不同.2. 3　流式细胞仪定量分析细胞凋亡为了更加精确地定量分析细胞凋亡,我们用流式细胞仪测定几组细胞, 结果如图 2所示,在 ZR-75-1细胞中, RAR受体选择性视黄素, 如 t-RA、11365能够显著地诱导细胞凋亡,细胞凋亡分别为 57. 6%和 27. 4% ; 而在 MB-231细胞中, 其诱导作用显著下降,细胞凋亡仅为 3.6%和 5. 5% . 当 RXR受体选择性视黄素, 如 11246、11345诱导乳腺癌细胞时, 结果相反, 在·266·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　1998 年　　　图 1　不同的 RAR和 RXR 受体选择性视黄素对乳腺癌细胞细胞凋亡的诱导　　　Fig . 1　Induction of apopto sis by RAR- and RXR-selectiv e retino ids in br east cancer cellsZR-75-1细胞中,细胞凋亡仅为 4. 7%和 5. 1%, 但在 MB-231细胞中则显著上升为 33. 9%和19. 9% ,这一诱导趋势同上面统计结果趋势类似. 当 RAR-和 RXR受体选择性视黄素( 11345+ 11365)联合使用时, 细胞凋亡分别上升为 31. 4%( ZR-75-1细胞)和 27. 4% ( MB-231细胞) ,作用显著大于单独使用视黄素.2. 4　不同的视黄素对癌细胞生长的影响图 3结果显示, RAR受体选择性视黄素能够有效地抑制 ZR-75-1细胞的生长, 生长抑制率为70%～80% ,而对MB-231细胞生长则无显著的抑制作用,相反, RXR受体选择性视黄素能够有效地抑制 MB-231细胞生长,生长抑制率在 50%左右( 11345例外) , 当一系列 RAR 受体选择性视黄素与 RXR受体选择性视黄素 11345联合使用时, 对癌细胞的抑制作用更大, 表明不同类型的受体选择性视黄素联合使用能够产生加强作用.2. 5　RARA基因转染与视黄素诱导细胞调亡的关系在 MB-231细胞中 RARA基因不表达[ 13] ,而且 RAR受体选择性视黄素几乎不能诱导细胞凋亡,将 RARA基因转染 MB-231细胞后[ 13] ,再测定细胞凋亡, 发现在两株转染细胞( M B-231/ RARA# 2和 MB-231/ RARA# 4)中, RAR 受体选择性视黄素诱导细胞凋亡的能力显著提高, 并且诱导能力超过 RXR受体选择性视黄素(图 4) ,诱导趋势与对 ZR-75-1细胞的诱导趋势(图 1)类似,提示细胞凋亡的诱导与 RARA基因表达存在某种关系.进一步测定细胞生长抑制率,发现这两株细胞的生长同样被 RAR受体选择性视黄素有效地抑制(图 5) , 抑制趋势也与对 ZR-75-1细胞生长的抑制趋势(图 3)类似.3　讨　论细胞凋亡是一种限制细胞生长的重要途径,可以导致肿瘤的退化[ 1, 2] .在许多情况下,细胞凋亡能够被大量因子,如类固醇、生长因子、信号传导胞内介导因子,以及在 DNA 复制和细胞·267·第 2期　　　　　吴　乔等:视黄素诱导的癌细胞凋亡及其对癌细胞生长抑制的相关性　　　　　　　　　　图 2　流式细胞仪分析视黄素诱导 ZR-75-1 和 MB-231 细胞中的细胞凋亡　　Fig . 2　Analysis o f apopto sis induced by r etino cids in ZR-75-1 and MB-231 cells use FACScater-P lus周期中的核蛋白调节因子所调控[ 2]. 目前已报道,类固醇激素, 如糖皮质激素能够诱导淋巴母细胞的细胞凋亡而对白血病产生作用 [ 11] ; 视黄素能够诱导造血细胞[ 8]以及几种小肺癌细胞株[ 12 ]的细胞凋亡, 正常的细胞凋亡受到抑制,将引起非正常的细胞生长和恶性增殖, 所以, 通过人工手段诱导细胞凋亡, 能够抑制肿瘤细胞的恶性生长,这可能是一些抗癌药物发挥其抗癌活性的重要机制.·268·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　1998 年　图 3　RAR-和 RXR 受体选择性视黄素对 ZR-75-1 和 MB-231 细胞生长抑制的影响　Fig . 3　The effect o f RAR-and RXR-selectiv e retinoids on the g rowt h inhibit ion of ZR-75-1 and MB-231 cells　图 4　视黄素对 MB-231/ RARA克隆细胞的细胞凋亡的影响　Fig . 4　The effect o f retino ids on apoptosis o f MB-231 cells tr ansfected w ith RARA gene·269·第 2期　　　　　吴　乔等:视黄素诱导的癌细胞凋亡及其对癌细胞生长抑制的相关性　　　　　　　　　图 5　视黄素对 MB-231/ RARA克隆细胞的生长抑制影响　F ig . 5　The effect of r etino ids on t he g r ow th inhibition of M B-231 cells tr ansfected with RARAgene本文从形态学观察,统计数据或者流式细胞仪的定量分析,都一致证实视黄素能够诱导乳腺癌细胞的细胞凋亡. 荧光显微镜下看见细胞核固缩,染色体断裂等典型的细胞凋亡形态变化(图版Ⅱ) ,流式细胞仪精确测定细胞凋亡(图 2) ,其中 t-RA 诱导 ZR-75-1细胞的细胞凋亡达到 57. 6% .更为重要的是,不同的受体选择性视黄素诱导细胞凋亡能力不同.在激素依赖性乳腺癌 ZR-75-1细胞中, RAR 受体选择性视黄素能够有效地诱导细胞凋亡, 而 RXR受体选择性视黄素则无明显的诱导作用(图 1, 2) .相反,在激素非依赖性乳腺癌 MB-231细胞中, RXR受体选择性视黄素诱导细胞凋亡的能力则高于 RAR受体选择性视黄素(图 1, 2) . 结果不仅表明不同细胞株对视黄素的敏感性不同,不同的受体选择性视黄素诱导细胞凋亡的能力也不同,而且提示细胞凋亡的诱导可能与某些视黄素受体表达有关.视黄素的作用主要通过其受体 RARs和 RXRs介导[ 10]. 我们已证实, RARA在 MB-231细胞中不表达, 但在ZR-75-1细胞中高水平表达[ 13] .当RARA基因转染MB-231细胞,并且稳定表达 RARA时[ 13] ,测定细胞凋亡的结果表明, RAR 受体选择性视黄素能够有效地诱导细胞凋亡(图 4) ,诱导趋势与对 ZR-75-1细胞的诱导趋势(图 1)类似.由于视黄酸受体活性的改变可能引起细胞凋亡的抑制, 由此导致细胞生长异常和肿瘤加速形成 [ 14] . 还有在小鼠肢芽发育过程中,某些视黄酸受体的表达被高度地限制在某些区域,而这个区域则被认为是进行细胞凋亡的区域[ 15].因此以上结果提示,细胞凋亡的诱导可能与 RARA基因表达有关.另外,我们的结果还进一步佐证细胞凋亡的诱导可以抑制癌细胞恶性增殖[ 9, 10]的结论, RA R受体选择性视黄素能够有效地抑制 ZR-75-1细胞生长,而RXR受体选择性视黄素则有效地抑制MB-231细胞生长(图 3) , 结果与视黄素诱导的癌细胞凋亡相对应,这可能是视黄素抑制癌细胞生长的另一重要途径.而且当 RARA基因转染 MB-231细胞后, RAR受体选择视黄素同样能够有效地·270·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　1998 年抑制癌细胞生长(图 5) , 诱导细胞凋亡(图 4) , 所以 RARA可能介导视黄素对癌细胞的生长抑制和细胞凋亡的诱导, 使癌细胞对视黄素更加敏感, 而这一转变对于临床治疗意义重大,因为激素依赖性乳腺癌细胞通常代表那些早期的、恶性程度较低的乳腺癌,而激素非依赖性乳腺癌细胞则代表那些攻击性强、恶性程度高的晚期乳腺癌, 因此当 RAR-和 RXR 受体选择性视黄素联合使用时产生的加强作用, 无疑在临床上治疗早、晚期恶性乳腺癌具有重要的理论指导意义,这也为如何更好地开发视黄素治疗癌症开辟了新思路.参　考　文　献1　F iser D E. Apoptosis in cancer t her apy: cro ssing the thresho ld. Cell. 1994, 78: 539～5422　St eller H. Mechanism and genes of cellular suicide. Science. 1995, 267: 1 445～1 4623　Ker r J F et al. A basic bio log ical phenomenon w ith wider r angering implication in t issue kinet ics. Br. J.Cancer . 1972, 26: 239～2574　Delia D et al. Regulation o f apoptosis induced by t he retino id N-( 4-hydroxyphenyl) r etinamide and effecto f deregulated bcl-2. Blood. 1995, 85: 359～3675　Gudas L J et al. Cellular biolog y and biochemistr y oft he r etino ids. The Ret inoids. 2nd edition. Raven Press. New York. 1994, 443～5206　Lot an R. Effect of vitamin A and it s analo gs ( retino ids) on normaland neoplastic cells. Bio chem . Bio-phys. Acta. 1981, 605: 33～917　Chambon P . T he retino id signaling pathway: mo lecula r and genetic analyses. Semin. Cell Biol. 1994, 5:115～1258　Nagy L et al. Activation o f r et inoid X receptor s induces apopto sis in HL-60 cell lines. Mo l. Cell. 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Retino ic acid receptor and CRABP in the developing limbs of the mouse . Nat ur e( London) .1989, 342: 702～705·271·第 2期　　　　　吴　乔等:视黄素诱导的癌细胞凋亡及其对癌细胞生长抑制的相关性　　　　　　　　S tudy on the relationship between Apoptosis and Grow thInhibit ion Induced by Ret inoids in Cancer CellsWu Qiao　Zheng Yun　Zhang Xiaokun( The State and SEDC Res. Lab. for T umor Cell Eng ineer ingin Xiamen Univ ersity, Xiamen　361005)Abstract　Ret inoid exerts it s ef fect through tw o types o f r et inoid receptors, theret inoic acid receptors( RARs) and ret inoid X receptor s( RXRs) . In this study, w e investi-gated the relat ionship betw een apoptosis and g row th inhibit ion induced by RAR-and RXR-select ive r et ino ids in breast cancer cel l lines, using f luorescent micro scopy , T dT assay andM TT assay. In addit ion, RARA gene w as stable t ransfected into RARAnegat ive breast can-cer cel l line, M B-231 cells, apopto sis w as induced. A synergist ic g row th inhibitor y ef fectand apoptosis w ere observed on combining RAR- and RXR-select ive retinoids. Our resultsdemonstr ate that ret inoids can induce apoptosis in breast cancer cell lines, and contribute togr ow th inhibit ion of br east cancer cells. These may represent an important anti-tumor mecha-nism o f retinoic acid.Key words　Receptor-select ive retinoid, Apopto sis, Grow th inhibit ion, Breastcancer cell l ines图 版 Ⅰ　　　　　　　　　图版 Ⅱ图版说明图版Ⅰ　荧光显微镜观察乳腺癌细胞的细胞核(对照组)图版Ⅱ　荧光显微镜观察 t -RA 诱导的乳腺癌细胞的细胞凋亡.↑示发生细胞凋亡的细胞Fig . 1　T he observ ation o f fluo rescent micr oscope on nuclei in br east cancer cells ( Contr ol)Fig . 2　T he observ ation o f fluo rescent micr oscope on apoptosis induced by t -RA in brea st cancer cells·272·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　1998 年

视黄素诱导的癌细胞凋亡及其对癌细胞生长抑制的相关性

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/54172/%e8%a7%86%e9%bb%84%e7%b4%a0%e8%af%b1%e5%af%bc%e7%9a%84%e7%99%8c%e7%bb%86%e8%83%9e%e5%87%8b%e4%ba%a1%e5%8f%8a%e5%85%b6%e5%af%b9%e7%99%8c%e7%bb%86%e8%83%9e%e7%94%9f%e9%95%bf%e6%8a%91%e5%88%b6%e7%9a%84%e7%9b%b8%e5%85%b3%e6%80%a7.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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