以香蕉 (Musa spp.)的横切薄层切片 (transverse thin cell layer,t TCL)外植体作为转化受体 ,通过对外植体 GUS基因瞬时表达率的研究以及受体材料对抗生素的敏感性实验 ,找出了较适合的外植体转化条件和培养条件。研究表明 :用低代香蕉无菌苗为材料 ,横切薄层切片芽再生率高 ,有较高的 GUS基因瞬时表达率 ;香蕉对头孢霉素 (Cefotaxime)和羧苄霉素 (Carbenicillin)不敏感 ,而对潮霉素(Hygromycin)很敏感 ;菌液的预处理是影响香蕉转化的主要因子 ,重悬液中的蔗糖浓度也是影响转化的因素之一 ,对遗传转化有明显的促进作

夏宁邵

张军

李杨瑞

陈丽新

陈如凯

陈廷速

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α文章编号: 1008 3464 (2002) 01 0026 06影响根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化因素研究陈廷速1, 2, 3, 张军1, 夏宁邵1, 陈丽新3, 陈如凯2, 李杨瑞3　 (1　厦门大学肿瘤细胞工程教育部重点实验室, 福建 厦门 361005 ; 2　福建农林大学, 福建 福州 350002;3　广西农业科学院, 广西 南宁 530007)摘要: 以香蕉 (M usa spp. ) 的横切薄层切片 ( transverse th in cell layer, tTCL ) 外植体作为转化受体,通过对外植体 GU S 基因瞬时表达率的研究以及受体材料对抗生素的敏感性实验, 找出了较适合的外植体转化条件和培养条件。研究表明: 用低代香蕉无菌苗为材料, 横切薄层切片芽再生率高, 有较高的 GU S 基因瞬 时表达率; 香蕉对头孢霉素 (Cefo tax im e ) 和羧苄霉素 (Carben icillin ) 不敏感, 而对潮霉素(H ygrom ycin) 很敏感; 菌液的预处理是影响香蕉转化的主要因子, 重悬液中的蔗糖浓度也是影响转化的因素之一, 对遗传转化有明显的促进作用。关键词: 香蕉; 根癌农杆菌; 遗传转化; 横切薄层切片中图分类号: Q 785　　　文献标识码: AStudy on the inf luence factors of the frequency of A g robacter iumm ed ia ted tran sformation in banana (M usa spp. )CH EN T ing su1, 2, 3, ZHAN G Jun1, X IA N ing shao 1CH EN L i x in3, CH EN R u kai2, L I Yang ru i3(1 T umou r Cell Engineering L ab of X iam en U n iversity, X iam en 361005, Ch ina;2 Fu jian A gricu ltu re and Fo rest ry U n iversity, Fuzhou 350002, Ch ina;3 Guangx i A cadem y of A gricu ltu re Science, N ann ing 530007, Ch ina)Abstract: In th is paper, t ran sien t exp ression of Β glucu ron idase (GU S) gene w as u sed to op t im izethe b io logica l condit ion s m edia ted by A g robacterium tum ef aciens fo r t ran sverse th in cell layer ( tTCL )of fru it banana (M usa spp. ). It show ed that low genera t ion of in v itro p lan t lets had greater shoo tregenera t ion and h igher GU S gene tran sien t exp ression w hen tran sverse th in cell layer ( tTCL ) w asu sed. Cefo tax im e and carben icillin w ere in su scep t ib le w h ile hygrom ycin w as ra ther sen sit ive tobanana. T he p retrea tm en t of A g robacterium liqu id w as one of the mo st impo rtan t facto rs in bananagenet ic t ran sfo rm at ion, and it included the concen tra t ion of sucro se.Key words: banana; A g robacterium tum ef aciens ; genet ic t ran sfo rm at ion; t ran sverse th in cell layer( tTCL )第 21 卷　第 1 期V o l121, N o11广 西 农 业 生 物 科 学Journal of Guangxi A gric. and B io l. Science2002 年 3 月　M ar. , 2002　α 收稿日期: 2001 08 15基金项目: 福建省自然科学基金项目 (C9910004) ; 厦门凯立生物制品有限公司资助项目作者简介: 陈廷速 (1966 ) , 男 (壮族) , 广西上思人, 广西农科院助理研究员, 博士研究生; 夏宁邵为联系通信人。农杆菌介导的香蕉遗传转化研究虽然已有报道[1, 2 ] , 但其是结合基因枪才将报告基因或外源基因导入香蕉, 并获得了转基因植株。有关利用农杆菌进行香蕉遗传转化是国内外研究的热点。已有用基因枪来进行转化并获得转基因植株[3 ]或利用基因枪来研究转化条件, 未获得转基因植株[4 ] , 基因枪转化同时带来转化体的遗传稳定性问题。因此, 香蕉遗传转化条件还需作进一步优化。我们在进行利用香蕉表达医药蛋白的研究中, 对香蕉的遗传转化受体材料进行了较深入的探讨, 以期找到最佳的受体材料以提高转化效率, 为香蕉转化工作积累经验。1　材料和方法111 实验材料供试香蕉品种为威廉斯 (W illiam s) 的低代香蕉试管苗, 由广西农科院生物所提供。112　农杆菌菌株与质粒根癌农杆菌菌株为 EHA 105, 植物表达载体 p 1301hEGF (含有 GU S 基因、N PT Ê 基因、H PT 基因、人表皮生长因子基因 hEGF) , 结构如图 1。图 1　p1301hEGF 质粒结构图F ig. 1　Con struction of p1301hEGF113　农杆菌在转化前的预处理取菌液接种于 YEB + Kan (Kanam ycin) 25 m göL 的培养基中, 在 28 ℃和 180～ 250 röm in 条件下振荡培养至OD 600为 018～ 110。将培养好的菌液在 4 500 röm in 条件下离心 10 m in, 然后将菌体重悬于BM 3 培养基中 (1∶1) , 28 ℃条件下振荡培养 10～ 12 h 用于转化。114　培养基及培养条件( 1) 横切薄层切片芽诱导培养基 (BM 1) : 改良的M S 培养基+ BA 410 m göL + NAA 015 m göL ;(2) 丛芽增殖培养基 (BM 2) : 改良的M S 培养基+ BA 315 m göL + NAA 013 m göL ; (3) 重悬菌液的培养基 (BM 3) : 1ö2 改良的M S 培养基+ A S (aceto syringone) 80 Λmo löL + 蔗糖 100 göL , 不加琼脂,pH 510; (4) 共培养阶段的培养基 (BM 4) : BM 1+ A S 80 Λmo löL , 培养温度为 24～ 26 ℃; (5) 筛选培养基 (BM 5) : BM 1+ Cef (Cefo tax im e) 400 m göL + H yg (H ygrom ycin) 10 m göL。以上培养基以及培养条件如不加以说明均附加蔗糖 3% , 琼脂 0156% , pH 518, 均进行暗培养, 培养温度为 30 ℃。115　香蕉横切薄层切片与农杆菌共培养将低代香蕉试管苗除去假茎和褐化的组织, 仅留顶芽和有分化能力的组织并将之横切成 1～ 2 mm的薄层切片。将其移入准备好的菌液中, 在 28 ℃、120 röm in 条件下振荡 8～ 10 m in, 取出薄层切片转入BM 4 培养基中培养 4 d, 再转入BM 5 进行筛选。116　实验方法从田间取回健壮的香蕉吸芽, 经过一定的处理并在超净工作台上剥取顶芽, 接种在培养基(BM 1) 上, 每 20 d 继代一次; 之后转接在增殖培养基 (BM 2) 进行增殖即为所用的材料。在进行抗生素的敏感性实验时, 通过预实验我们确定头孢霉素和羧苄霉素的浓度为: 300, 600, 1000 m göL ; 卡那霉素和潮霉素的浓度为: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 m göL ; A gNO 3 的浓度为: 0, 2,5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 m göL ; 每 5 d 对实验进行观察并记录生长情况, 每个实验设计 3 个重复, 40 d 统计结果。117　GUS 报告基因的检测取经转化的薄层切片用X- Gluc 染液 (参考改进的 Jefferson 方法[5 ]) , 37 ℃温水浴 12 h, 镜检观测 GU S 基因表达的蓝斑。瞬时表达率 (% ) = (GU S 基因瞬时表达的外植体数ö总外植体数) ×100%。72第 1 期 陈廷速等: 影响根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化因素研究2　结果和分析211　抗生素对香蕉横切薄层切片芽分化的影响在植物基因工程中, 一般使用两种抗生素即抑菌性抗生素和选择性抗生素。抑菌性抗生素主要用在筛选转化体的过程中抑制农杆菌的生长但又不影响外植体的生长; 选择性抗生素主要用来筛选转化细胞或植株。在香蕉的转化研究中, 抑菌性抗生素我们用头雹霉素和羧苄霉素, 选择性抗生素用卡那霉素和潮霉素, 从抗生素敏感性实验结果 (表 1、表 2、表 3) 可明显看出: 香蕉对头雹霉素和羧苄霉素不敏感, 在其浓度很高情况下仍有芽分化; 而香蕉对卡那霉素和潮霉素都敏感, 尤其对潮霉素更敏感, 在潮霉素浓度为 5 m göL 时很明显地抑制薄层切片的芽分化, 在 10 m göL 时前期薄层切片能长芽,但随后开始出现白化现象, 35 d 左右可使切片及幼芽褐化死亡。因此, 我们以这浓度为筛选压力。卡那霉素可使薄层切片分化的植株白化, 最后也褐化死亡, 但这个抑制过程较长, 需要 50 d 以上。表 1　头雹霉素和羧苄霉素对香蕉横切薄层切片芽分化的影响Table 1　Effect of cefotax ime and carben ic ill in on shoot regeneration of banana tran sverse th in cell layer统计项目Statist ical item s头孢霉素浓度Cefo tax im eöm g·L - 1ck 300 600 1000羧苄霉素浓度Carben icillinöm g·L - 1ck 300 600 1000薄层切片总数 50 50 50 50 50 50 50 50N o. of tTCL出芽的薄片数 40 38 37 39 36 35 33 36N o. of tTCL w ith shoo ts不定芽数N o. of shoo ts 85 76 70 73 85 87 85 81芽分化率ö% 80 76 74 78 72 70 66 72Percen tage of shoo t regenerat ion表 2　卡那霉素对香蕉横切薄层切片芽分化的影响Table 2　Effect of kanamyc in on shoot regeneration of banana tran sverse th in cell layer统计项目Statist ical item s卡那霉素处理浓度 Kanam ycin concen tra t ionöm g·L - 10 5 10 15 20 25 30薄层切片总数N o. of tTCL 50 50 50 50 50 50 50出芽外植体数N o. of tTCL w ith shoo ts 43 37 35 36 30 30 25正常不定芽数N o. of no rm al shoo ts 90 75 0 0 0 0 0白化苗总数N o. of ch lo ro tic shoo ts 0 0 60 64 55 45 40芽分化率 Percen tage of shoo t regenerat ionö% 86 74 70 72 60 60 50表 3　潮霉素对香蕉横切薄层切片芽分化的影响Table 3　Effect of hygromyc in on shoot regeneration of banana tran sverse th in cell layer统计项目Statist ical item s潮霉素处理浓度H ygrom ycin concen tra t ionöm g·L - 10 5 10 15 20 25 30薄层切片总数N o. of tTCL 50 50 50 50 50 50 50出芽外植体数N o. of tTCL w ith shoo ts 39 30 24 24 18 0 0正常不定芽数N o. of no rm al shoo ts 66 51 0 0 0 0 0白化苗总数N o. of ch lo ro tic shoo ts 0 0 38 33 30 0 0芽分化率 Percen tage of shoo t regenerat ionö% 78 60 48 48 36 0 082 广 西 农 业 生 物 科 学 第 21 卷　212　AgNO 3 对香蕉横切薄层切片芽分化的影响关于A gNO 3 在植物离体培养中的作用机理, 有的研究认为A gNO 3 能提高外植体不定芽分化率[6, 7 ]。研究发现, A gNO 3 对甘蓝、桑树的遗传转化有促进作用, 可能A g+ 抑制农杆菌的生长, 可以减轻组织褐化死亡的程度[8, 9 ]。我们研究A gNO 3 对香蕉横切薄层切片芽分化影响的结果说明在一定浓度范围内, A gNO 3 能提高香蕉横切薄层切片芽再生率和不定芽的分化率。213　外植体条件对 GUS 基因瞬时表达率的影响植物的遗传转化随着遗传转化机理研究不断深入以及转化方法的改进得以迅速发展, 已在不同植物上用叶片、叶柄、子叶、胚轴、茎、茎尖分生组织、根、幼胚等作外植体进行转化。不同物种所要求的外植体种类可能不同, 即使同一物种, 不同的外植体转化效率也有差别。外植体的年龄是影响转化频率的重要因素之一, 在对黄瓜、甜瓜、西瓜的遗传转化研究中, 发现采用顶端幼嫩组织或 4～ 5 d图 2　外植体条件对 GUS 基因瞬时表达率的影响F ig. 2　Inf luence of explan t condition s on GUSgene tran sien t expressionA - 低代试管苗; B - 高代试管苗; C- 生根试管苗。A - L ow generation; B - H igh generation;C- P lan tlet w ith roo ts.苗龄的子叶转化效果好[10 ]。这说明不同发育时期的外植体, 其器官或胚胎发生的潜力有明显的差别, 同时也表明不同发育时期的外植体, 对农杆菌存在着一个最佳感受态问题。香蕉是单子叶植物并且组织褐化严重, 从我们进行香蕉的试管苗的长期生产和研究中发现, 利用暗培养可以提高丛芽的分化率, 芽组织的酚类物质较少。在利用横切薄层切片对香蕉芽分化的研究中, 建立了较好的薄层切片的植株再生体系。采用这种方法可提高外植体芽的分化率, 与用假茎进行的薄片培养通过愈伤组织再诱导芽分化[11 ]相比, 能较快地建立再生体系。我们研究发现:利用香蕉低代材料进行的转化得到的 GU S 基因瞬时表达率最高 (图 2) , 而用代数高或其它材料不仅瞬时表达率低, 而且组织褐化十分严重。我们认为在低代材料中, 叶原基的分生组织较多, 有较大潜在的芽分化能力。214　农杆菌重悬液中蔗糖浓度对 GUS 基因瞬时表达率的影响图 3　蔗糖浓度对 GUS 基因瞬时表达率的影响F ig. 3　Effect of sucrose concen tration on GUSgene tran sien t expression农杆菌 vir 基因的诱导, 除酚类化合物和重悬液 pH 值外, 还有其它影响因素。培养基中糖浓度可促进 vir 基因的表达。在水稻的转化中使用高浓度的糖能提高转化效率[12 ]。我们曾以蔗糖和葡萄糖的不同组合来研究瞬时表达, 但没有单纯用蔗糖效果明显。因此我们以不同的蔗糖浓度详细研究瞬时表达 (图3) , 在蔗糖浓度 100 göL 条件下, 薄层切片的 GU S 基因瞬时表达最好。3　讨　论在进行香蕉遗传转化研究中, 受体系统和转化方法是外源基因能否导入香蕉的基础。在已有的获得香蕉转基因植株的报道中[1～ 3 ] , 都是利用基因枪或间接于基因枪才获得转基因植株, 对其遗传稳定性需要进一步的研究。因此, 开展有关影响农杆菌介导的香蕉转化的因素的研究有着理论和应用的价值。单子叶和双子叶植物的创伤反应不同, 在单子叶植物的伤口附近往往发生木质化或硬化, 而且没92第 1 期 陈廷速等: 影响根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化因素研究有明显的细胞分裂发生, 因而两者的转化机理有较大的区别。在对一些已成功用农杆菌转化的单子叶植物的研究中, 除了菌株和质粒的选择, 以及对促进 vir 基因的活化的因素进行优化之外, 研究所选择的转化体系 (受体系统) 需具备较高的感染率、芽分化率和转化植株易于再生为所首先考虑的条件。在我们进行的利用香蕉表达医药蛋白的研究中, 对影响农杆菌的一系列因子做了系统的研究并得到很高的报告基因的瞬时表达; 特别在受体材料的选择方面, 有着独特的一面, 所用的低代材料不仅芽生长点多, 其周围的组织都具有潜在的芽分生能力 (图 4 1, 2) [13 ] , 而且我们采用的横切薄层培养切片利于农杆菌对材料的吸附。同时, 横切薄层培养切片的芽分化率高, 缩短了对转化体筛选的时间, 最重要的是瞬时表达率较高 (图 4 3, 4, 5)。图 4　香蕉横切薄层切片芽分化及转化情况F ig. 4　The result of bud regeneration and tran sformation of banana tTCL1. 香蕉横切薄层切片暗培养 3 d 芽分化情况, 其中边缘突出部分为已分化的芽点;21 继续培养 5 d 之后芽分化的情况;31 用农杆菌进行转化但无 GU S 基因瞬时表达的香蕉横切薄层切片;41 用农杆菌进行转化有 GU S 基因瞬时表达的香蕉横切薄层切片, 其中A 部分为 GU S 蓝斑;51 没有用农杆菌进行转化但进行 GU S 检测的香蕉横切薄层切片。1. T he shoo ts regenerate under dark cu ltu re in th ree days. T ho ses p ro jecting beside the tTCL are buds;2. It show s that the buds develop in to shoo ts after 5 days;3. T he tTCL s of Banana treated w ith A g robacterium tum ef aciens w ithou t GU S gene transien t exp ression;4. T he tTCL s of Banana treated w ith A g robacterium tum ef aciens and the GU S gene transien t exp ression thatshow ed A ;5. T he tTCL s of Banana w ithou t treated w ith A g robacterium tum ef aciens but exam ined w ith GU S so lu tion.　　我们的研究结果说明香蕉对抑菌性抗生素 (头孢霉素和羧苄霉素) 很不敏感。在许多文献中, 一些研究者在共培养之后往往用 500 m göL 的抑菌性抗生素来杀菌, 而有的材料即使在筛选培养基加上抑菌性抗生素也很难彻底抑制农杆菌的生长。我们用 800～ 1 000 m göL 抑菌性抗生素来处理就得到很好的效果。目前选择性抗生素一般都选择卡那霉素和潮霉素, 但香蕉对卡那霉素不敏感, 用植株做敏03 广 西 农 业 生 物 科 学 第 21 卷　感性实验时, 需要筛选 150 d 才得到结果; 而用横切薄层切片做敏感性实验时, 得到相似的结果也要 50d 左右。香蕉对潮霉素很敏感, 在 10 m göL 浓度下芽生长受到抑制, 筛选所用的时间短。此外, A gNO 3 在低浓度下能促进香蕉芽的分化, 至于对转化的作用机理有待进行探讨。我们在研究重悬液的成分对农杆菌介导香蕉转化的影响时, 研究了葡萄糖和蔗糖的作用。结果仅有单独用蔗糖且在 100 göL 时才得到较高的 GU S 基因的瞬时表达。这可能是含有蔗糖的重悬液经过高温灭菌之后,蔗糖转变为一些单糖类物质, 它们对 vir 基因有活化作用, 其作用机制需进一步的研究。参考文献:[ 1 ] 　 GR EGOR Y D M ay, ROWNA K A fza, HU GH S M ason, et a l. Generation of transgen ic banana (M usaacum ina ta) p lan t via A g robacterium m ediated transfo rm ation [J ]. B io techno logy, 1995, 13: 486～ 492.[2 ] 　李华平, 胡晋生, 王敏, 等. 香蕉茎尖遗传转化法研究 [J ]. 热带作物学报, 2000, 21 (4) : 33～ 38.[ 3 ] 　LA SZLO Sagi, BA R T Panis, SER GE R em y, et a l. 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影响根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化因素研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21266/%e5%bd%b1%e5%93%8d%e6%a0%b9%e7%99%8c%e5%86%9c%e6%9d%86%e8%8f%8c%e4%bb%8b%e5%af%bc%e7%9a%84%e9%a6%99%e8%95%89%e9%81%97%e4%bc%a0%e8%bd%ac%e5%8c%96%e5%9b%a0%e7%b4%a0%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

影响根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化因素研究

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