报道了某些双齿配体对固氮酶促反应影响的研究结果．发现１，２－双（二苯基磷）－乙烷（ＤＰＰＥ）对固氮酶酶促乙炔还原反应有促进作用，但同时又抑制了固氮酶的放氢反应。而比ＤＰＰＥ少一个－ＣＨ２－链的双（二苯基磷）－甲烷（ＤＰＰＭ）却不能表现出对固氮酶促乙炔还原活力的促进作用．对照固氮酶ＭｏＦｅ－蛋白Ｘ－光衍射结构分析结果和量子化学近似计算所导出的固氮酶活性中心结构模型提出了ＤＰＰＥ促进酶促乙炔还原反应的一种可能的解释

万惠霖

刘爱民

张凤章

张鸿图

蔡启瑞

袁友珠

许良树

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第 8 卷 第 2 期1 9 9 4 年 4 月分 子 催 化JO U R N A L O F M O LE C U L A R C A T A L Y SIS (CH IN A )V o l.8,N o.2A Pr二 1 9 9 4研究论文 81 一 85优化固氮活性模型信息研究 (U—双齿配体D PPE 和 D PPM 对固氮酶促反应的影响刘爱民, º 张凤章士 张鸿图’袁友珠‘许 良树 , 万惠 霖 笃‘ 、义蔡启瑞‘ ’( 厦门大学化学系十 ,生物 系;.固体表面物理化学 国家重点实验室 、.厦 门 36 1 0 05摘 要 报道了某些双齿配体对固氮酶促反应影响的研究结果.发现 1.2一双 ( 二苯基磷卜 乙烷( DP PE) 对固氮酶酶促乙炔还原反应有促进作用,但同时 又抑制了固氮酶的放氢反应.而 比 D PP E少一个 一CHZ一 链的双 (二苯基磷 )一甲烷 ( D PP M )却不能表现出对固氮酶促乙快还原活 力的促进作用.对照固氮酶 MoF e一蛋白 X一光衍射结构分析结果和量子化学近似计算所导 出的 固氮酶活性中心结构模型提出了 D PPE 促进酶促乙炔还原反应的一种可能的解释.关镇词 固氮酶,双齿配体,促进剂.抑制剂、前- J L es. . . . 门口目 . . .亡 J天然固氮酶催化还原 NZ为 N H:的过程长期受到人们关注.最近.Bo lin 和 R es等分别独立采用 X一光衍射分析固氮酶 MoFe 一蛋白,给出一r 0.28 n m 一 0.2 n m 分辨率的 M一簇 (体 外时称 Fe M o一 e o fa e to r 或 Fe M o一 e o )和 P一簇的 结构模 型“ 6〕.前 者是 由两 个缺 ( 活 ) 日 立 方烷,Fe 石:和 M oFe 召3簇,靠两个硫和一个 Y 配体 (氧、氮或硫 )桥连形成的具有近似 C3、对称性 的笼状原子簇结构,M。 原子处在一端的角落位置上.该模型可表示为〔L3MoF e3S 3〕(脚一5)2 (脚一Y )〔Fe 汤Ll 〕; P一簇则主要是 由两个〔Fe4S4 〕组成.MoFe 一蛋白晶体结构分析结果使得固氮酶活性中心结构的研究又上了新的台阶〔7〕.但是,问题并没有彻底解决.在该模型中.配体 ( Y )的种类尚未最终确定阁,完整的结构参数也有待给 出.对于固氮酶底物活性 中心 M一簇而言,酶的十几种底物及抑制剂是揭示和检验其化学结构与功能关系的有力工具.本工作在以前化学探针方法研究固氮酶活性中心结构工作的基础上9 一 ‘’〕,考察了一系列具有双齿结构的有机配体对固氮酶促反应的影响,从 中寻找 出固氮酶的新抑制剂和促进剂并以其作为揭示酶活性 中心结构与功能的新探针.本文报道了双齿含磷有机化合物改变固氮酶促底物还原行为 (促进或抑制 )的研究结果; 并以化学探针的思路对实验结果提出了初步解释.一9 9 3 年 8 月 10 日收到初稿,一9 9 3年 11月 29 日收到修改稿.¹ 国家基础性研究重大关键项目 (攀登计划 )子课题及人事部专家司博士后经费资助项 目.º黄静伟、扬 如、周明玉同志参加了本工作.Á 通讯联 系人.分 子 催 化 第 8 卷2. 材 料 与 方 法双 (二苯基磷升甲烷和 1,2一双 (二苯基磷卜乙烷晶体由本实验 室合成.邻苯 二 甲醛 为市售分析纯.反应 系统 C p、Ck、A T P 和连二亚硫酸钠等都经无氧处理并保存于氢气氛中备用·固氮酶铁蛋 白、钥铁蛋 白依文献门 2一’‘〕的分离纯化方法从 彻.23 0 菌 (沈阳应用生态研究所发酵 )「}, 得到.所有实验均在绝氧条件下操作完成.反应时,分别取一定量 (约 0.05 ml,蛋白浓度为 10.0 m g / m l)的固氮酶铁蛋白、钥铁蛋白和固氮酶全酶 (Fe 一p r o te in + M o F e一P r o te in )于严格无氧条件下按摩尔比 Mo : L 一 1.0 : 1.1 加双齿配体 D PPE 或 D PPM、邻苯二甲醛.30‘C 水溶液中振 荡 反应 0.s h ; 然后 加入 固氮酶其余的组分蛋 白和反 应 系统 (A T P,C p,C k,M g C12 ,N a 多2。:)及底物 乙炔,重新置于温浴 中振荡反应.采用乙炔还原气相色谱法 ( 1 0 3 型气相色谱仪,氢火焰离子检测器 ) 测定固氮活性; 以 1 02 G 型色谱仪及热导池检测器测量固氮酶放氢活性.3.实 验 结 果双 齿含磷配体 D PPE、D PPM 和双齿配体邻苯二甲醛对固氮酶乙炔还原 比活力影响的结果歹U于表 1.衰 }.双齿配体对固氮的活性形响T a b le 1.T h e e ffe e rs o f so m e bid e n ta te 11助n ds o 仆 n itr o g e n a s e aCt iv ityE n z y rn a t leC o n t ra s tr e a e tlo no- Ph th a la ld e h y de D P PM D PP EA e t iv it y %’^ ct sv iry %‘A e t ivit y %’L 一g a n d s m ix ed wit hM o Fe 一P r o te 一n s o lu rjo nC Z H Z ~ CZ H 扭H 2 e v o lu tlo n5 8.88.3一 7 8.6一 7 8.353.25.4一 9.5一 3 4.97 2.83.4+ 2 3.8一 5 9.0L ig a n d、 m ix e d w i一hFe Pr o te 一n so lu tlo nC 竺H Z~ CZ H 刁H e v o lu t一o n4 2.09.5飞;.一 7 3.6一 6 5.33 9.55.8一 6.0一 3 8.9+ 19.5一 5 3.7L一g a n d、 m ix e d 认l th (’竺H Z 卡 (’ZH , 5 6.7 2 4n itr o g e 犷la s e “、o lu r一o n H 竺 e 、, o lu t 一o n 一 」3.849.8 一 12.2 7 0-3.9 一 18.8 3.+ 2 4.2一 35.4A e tjv ity : (n 叮n o ] C : 1 1 , fo rm ed /口1 9 p ro re 一n·m in ); R eae 一lu n t im e : 4 0 m 一n(C: H : ),Z h (HZ e v o lu t io n ).釜 八 e t lv 一ty / C o n r ra s t 资 关 F e 一Pr o re ln 斗一Mo F e 一P ro te in在测定放 H:量时.各组 (包括对照组 )都观察到一定时间 (一 4 h) 以后放 H:量剧增的情况.经分析认为是在反应系统中因长时间厌氧促使杂菌 (野生厌氧菌)繁殖造成的.单独 Fe-蛋白,单独 M o Fe一蛋 白加反应系统的空自试验 证实了上述推测.所以.在测放 H:量时,反应时间控制在 2 小时之内.从表 1 可以看出,D PPE 可使固氮酶的乙炔还·原活力提高约 20 %,而且不论 配体是先与固氮酶组分蛋 白预作 用还是直接与固氮酶全酶作用结果 皆相近.可见D PPE 是 新发现的固氮酶乙炔还原活力的促进剂,同时它 又使固氮酶放 HZ受到很强的抑制.与此同时,仅 比 D PPE 少一个 一 c HZ一 链的 D PPM 对固氮酶乙炔还原活力在同样条件下几乎没有 明显影响 (△、一5 % ),但 D PPM 对固氮酶放 H:也呈现出一定抑制作用.作为对 比,一个已知的固氮酶抑制剂 邻苯二 甲醛则同时强烈抑制 固氮酶的乙炔还原和放 H:活力.这三种双齿有机配体对固氮酶还原 N:成 N H3能力的影响尚待研究.第 2 期 刘爱 民等:优化固氮活性模型信息研究表 2.固氮酶的新促进剂与抑制剂T a b le 2.N e w Pr o m o t o r a n d in hib ito r s o f n itr o g e n a s e a etiv ity价Ph tha la ld ehy d e Ph ZPCH ZPPll Z Ph ZPC H ZCH ZPPh ZC : H :~ C:H,HZ e v o lu tio n告(I)讼(I)、 (l )二 (I)今(P )寺 (I)4.讨 论分子氮和 乙炔在固氮酶上的配位方式可能并非相同.文献中已有分子氮的还原必需 P一簇的协同作用,而 乙炔分子的络合活化则仅在 M一簇上即 可完成的报道『’5.Bo lin 和 Re es 等发表了固氮酶 M oFe 一蛋白 x一光衍射结构分析结果f‘ 6 1以后,陈明旦等交替使用分子图形学软件和分子力学计算对其进行了分子模型设计f’“〕 , 得 出了 Fe Mo 一co 模型的结构参数,刘爱 民等采用群 分 解E H M O 量子 化学方法〔, 7〕对Fe MO 一co 模 型进行 了近似 计算 [”·’。 .提 出 Re es 模 型中未知(a )H js 以 1 9 5 (或N H ) G ino lg l卜F e厂。27 5/、\C y s 一 S 丫 一 Fe l侧. . .o\F e 6 :、O , C C H。\ __才\ 厂 一f\丫 I〔二H Z C H Z C o ZF e 3.了才;、入.5\\s’一Fc4 \s一 Fe唁一伙厂0 厂厂、/ 泊is U ‘4“ N 、/ F e 又‘ ,// 2 . ~ ~ ~ ~.‘ ,尹/ 乙( Fe Z一F e 6 ~ 0.2 8 n m,Fe Z一F e s七 0.3 8 n m )( b )C y s日9 5/去丫、\、F|S一e、S|一|F一5ewe丰we日e、。:丫F|5.\C y s }3 1 5 3 5 2 5丫C y s 以 1 5 4C y sl弓1 8C y s{飞7 0 5S丫C y s 以 6 2去y s· 8 8图 1 ( a) 固氮酶 M一簇模 型; ( b) 固氮酶 P一簇模型F ig.l ( a ) Mod e l o f th e n i tr o g e n a se M一e lu s t e r ( Fe M o一e o ) ;( b ) S t ru e t u r e o f rh e n i t r o g e n a se P一 e lu s te r Pa ir.分 子 催 化 第 8 卷配体 (Y )应为 o 一或 N H 一 (图 la )的推论〔那 ,与 se llm ann几乎同时发表的经验性假设〔7〕相似.从图 1a 可 以看出,O PPE 分子既难以直接与 M。 络合,又没有合适的位置可挂在 M一簇上面 ; 但它的分子尺度与 P一簇 (图 lb )却较接近,一个可能的解释是 D PP E 抑制 了依赖 P一簇的某个放 H,中心,使得 A T P一驱动的电子传递 在分配上发生变化,即 M一簇可以获得更多的电子,所以在 M一簇上呈现出乙炔还原活力的提高.与此同时,D PPM 因少 了一个碳链,作用则明显不同.D PPM 对与 P一簇有关的放 H:中心的抑制较 D PPE 弱,且 因其双齿间距与 M一簇靠硫 (或氧 )配体桥联的双铁间距 (0.35 一 0.38 n m )相近 (图 la),所以它更可能抑制了固氮酶 M-簇的放氢位,从而对固氮酶乙炔还原活力显示出弱抑制作用.多数研 究人员 曾认为,每还原 1 摩尔 NZ成为 2 摩尔 N H3的 同时要 出 1 摩尔 H2 .即75 % 的 电子 (能量 )用于生成 N H3 ,25 %的电子 (能量 )用于放 HZ ,如式 1 所示N : + SH + + se一+ 1 6M gA T PN itr雌e n as eN a多2O月ZN H : + H:+ 16Mg A D P + 1 6PO 牙一(1 )但更深入的研究发现,纯固氮酶在正常条件下催化内源底物 H+ 还原放 H:所消耗的电子.却总是大于 25 %·即使在 50 大气压的 PN Z下,仍有 27 %的电子用于放 H2.在不同 NZ分压条件下,催化 NZ还原和 HZ释放反应动力学的定量分析〔, ,·2。〕都说明固氮酶除了在 M一簇上 固氮并同时放 出 H:以外,还应有另外的放氢位和放 H:中心 这个假设便成为产生上述解释的基础 ; 换言之,本文报道的研究结果也可理解为支持了固氮酶双位放氢假设.参考文献1 BO li n J T,R o n eo A E,M o r g a n T v e t a l二 乃1伏) 入飞侧 A ”过及坛.1 9 9 3,9 0:1 0 7 82 助一in J T.R o n e o A E.M o r te n so n L E e t a l ; G ras h o ff P M,R o th L E e t a 一 (Eds.), : “N itr o g e n F ix a tio n :A Ch iev em e n ts a n d3 K im J,R e es4 K im J.R e eso b je eriv es, , : Cha p m a n a n d H a ll,N ew Y o rk,19 9 0,1 1 7 一 12 2风伽汉r , 1 9 9 2.2 5 7:1 6 7 7‘从赵价丫, ,1 9 9 2,3 6 0。5 5 35 G e o r乡ad is M M,K o m iya H.C ha k ra bar ti P e t a l二6 C h a n M K,K im J,R e es7 Se llma n n D.A n尹 烈,乙护砂mD J. ,凡八砂刀理.1 9 9 3。2 6 0及 ,功汉犯,1 9 9 2,2 5 7:1 6 5 37 9 2Int 倪 产如列.19 9 3,3 2 (1 ):6 48 刘爱民,周泰锦,万惠霖等.高等学校化学学报,1 9 9 3,“ (7 ):9969 T sa l K R,Z h a n g H B,L in G D.Ad矛,切 法吸饱of 〔物刀a 一之劲r ”忍, 1 9 8 7,2:1 2 51 0 T sa i K R,wa n H L,z h a n s H T e t a l二 In“T h e N itr o ge n F ix a tio n a n d its R 瑞ea reh in e hin a” ,s p rin g e r一v e rla g,H e id e lber g,1 9 9 1.8 7n 张鸿图,扬 如,林国栋等.高等学校化学学报,19 9 2,13 (3 ):3 6212 曾 定,许良树,张凤章.厦门大学学报(自然科学版 ),1 9 8 0,19 (4 ):781 3 N e w to n W E.B u r ges B K,S tie fel E 1.N e w to n W E,Os tu k a S (Eds ),In: “M o ly比e n u m C h e m sst ry o f B io lo g ica l5 ig in ifican e s , ,.Ple n u m P r e s,N.Y. ,19 7 9,1 9 11 4 B u rses B K.C八叮刀 枷, ,1 9 9 0,9 0:1 3 7 7 ;H uan g H Q.K o ffo r d M,S im 哪o n F B.Wa rt G D.J 了瓜刀,夕 刀应龙‘内 刀,1 9 9 3,5 2 (l ):5 91 5 黄巨富,骆爱玲.解雪梅等.植物学报,19 9 0,32:11216 陈明旦,赖伍江,胡盛志.厦门大学学报 (自然科学版 ).1 9 9 3,32 (5): 5 917 刘爱民,周泰锦.张鸿图等.生物化学与生物物理进展,1 994.2 1 (2 )第 2 期 刘爱 民等:优化固氮活性模型信息研究 8 51 8 周泰锦,王南钦.厦门大学学报 (自然科学版 ),一9 8 5,2弓(3 ):3 4 51 9 S im pe o n R V,B u r r is R H.&,妇汉沦,1 9 8 4,2 2 4 : 1 0 9 520 张振水,吴柏和、李季伦.固氮酶催化的放 HZ反应,微生物学报,19 9 3,3 (5 ):3 20S tU d ie SC e n te ro n R a tio n a liz a tio n o f N itr o g e n a se A e tiv e-M o d elS N o v e l N itr o g e n a se In h ib ito r sa n d Pr o m o te r S a s C he m iCa l P ro b e SLiu A im in t,Z h a n g F e n , ha n g丰,Z h a n g H o n g t u 卞,Y u a n Y u z h o u tX u Lia n g sh u 丰,W a n H u ilin 谷十 ,T a s i K h ir u i ; 十(十 烧网刀t”“沉t of C九黔n汾梦,丰段夕旅浏 口按, 衬衍艺了夕 of the 段义以烧卿之”舰, “ of B衣欢圳,圣名勿劫 人匆 五么尸更滚刀,y f(刀,及厅孙℃ , X 。~石恤 z,。就夕,X 。~3 6 1 0 0 5 )A 加tr a CtIn Pr e v io u s w o r k fro m th is la bo ra to ry, n itro g e n a se s u bs tra te s o f a b o u t a d o z e n k n o w n type s we r er e g a r d e d a s e h e m ie a l Pro b e s, a n d m u ltin u e le a r eo r d in a tio n a e tiv a tio n o f th e e x o g e n o u s s u 眺tr a te s b ye u ba n e一lik e, o r tw in一 e u ha n e一lik e elu ste r s tr u e tu r a l a e tiv e一 e e n te r w a s in fe rr e d.R e e e n t Pu b lie a tio n sm ode ls o f n itr o g e n a se M一 e lu s te r a n d P一 e lu ste rs b y BO lin a n d R e e s 以 以.r ay d iffra e tio n d a ta w ith 0.2 8 a n d 0.2 2 n m reso lu tio n,h a v e sh e db a se d upo n s in g le一 e r y s讯lo fX-n e认产 o n th e S tt u Ctu r e o fn itro g e n a s ew h iC h a lte ra e tiv e e e n te r.In th e Pr e se n t w o r k,w e a im in fo t m a tio nligh tfro m n e w e h e m ie a l Pr o be sth e s u bs tra te spe eifie itie s (N: , a e e ty le n e, o rto g a inPr o to n r e d u e tio n e te.) o f n itro g e n a se.It w illb e v e ry u se fu l in e x a m in in g a n d u n d e rs ta n d in g th e s tr u e tu r e a n d fu n e tio n o f th e la t e st Pr o pose d m od e lo f n itr o g e n a se a e tiv e e e n te r.T h e be h a v io r s o f l,2一b is (d iPh e n ylPhos Ph in o )e th a n e, a Pr o m o te r o f in v itro n itr o g e n a sea e e ty le n ePr o be o fre d u e tiv e h y d ro g e n a tio n,b u t a n in h ib it o r o f h y d r o g e n e v o lu tio n re a e t io n, a s a n e we a ta ly z e dCh e m iC a ln ltr o g e n a s e a e tiv e e e n te r a reo 一P h tha la ld e h yd e a s a Po te n t in h ibito rr epo r te d, to g e th e r w ith m o r e d e ta ile d stu d y o n th e be ha v io rs o fo f n itr o g e n ase a e tiv ity.T h e Pre lim in a ry d a ta w e h a dH Ze v o lu t io n in n itr M o Fe -a c q u ire d a r e c o n sis te n t w ith the h ypo the s is o f th e t w o一 s ite m ode l o fPro te in.F u rth e rm o re,in a d d itio n to th e M一 e lu s te r,P一 elu ste r 15Pr o ba b lyin d ie a teil v o lv C do g e n a s ein th e s e e o n d s ite o f H Z e v o lu t io n.F u r th e r in fo r m a tio n Pro v id e d b y th is w o r kth a t th e fu n e tio n s o f M一& P一e lu ste r s in n itro g e n ase 。a ta lyz e d N : re d u e tso n r e a e tiv ityd iffe re n t fro m th a t o f a e e ty le n e r e d u e t io n,fo r e x a m Ple,N Z re d u tio n to N H 3 n e e d s as is ta n e ew h e r ea s a e e ty le n e r e d u e tio n docs n o t.m a y beo f M o,K ey w o r d s N itro g e n a se,B id e n ta re lig a n d s,P r o m o te r,In h ib it o r.

优化固氮活性模型信息研究──双齿配体DPPE和DPPM对固氮酶促反应的影响

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/55856/%e4%bc%98%e5%8c%96%e5%9b%ba%e6%b0%ae%e6%b4%bb%e6%80%a7%e6%a8%a1%e5%9e%8b%e4%bf%a1%e6%81%af%e7%a0%94%e7%a9%b6%e2%94%80%e2%94%80%e5%8f%8c%e9%bd%bf%e9%85%8d%e4%bd%93DPPE%e5%92%8cDPPM%e5%af%b9%e5%9b%ba%e6%b0%ae%e9%85%b6%e4%bf%83%e5%8f%8d%e5%ba%94%e7%9a%84%e5%bd%b1%e5%93%8d.pdf?sequence=1&isAllowed=y

优化固氮活性模型信息研究──双齿配体DPPE和DPPM对固氮酶促反应的影响

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