将含HCV/E2基因的重组质粒 pUC18/HCV -E2的BamHI酶切基因片段和NcoⅠ +HindⅢ酶切基因片段分别克隆到原核表达载体pRSETHis中 ,构建两株重组HCV/E2重组表达质粒 pRSET·C/E2和 pRSET·A/E2。在诱导表达中 pRSET·A/E2的外源基因获得了高效表达 ,而 pRSET·C/E2的外源基因完全未得到表达

周旭

夏宁邵

李益民

Xiamen University Institutional Repository

重组质粒二级结构对丙型肝炎病毒 E2蛋白基因表达的影响*周  旭1,李益民1, 夏宁邵2( 1.兰州生物制品研究所,兰州  730046; 2. 厦门大学, 厦门  36100)摘  要:将含 HCV/ E2 基因的重组质粒 pUC18/ HCV- E2 的 BamHI酶切基因片段和 NcoÑ + Hind Ó 酶切基因片段分别克隆到原核表达载体 pRSETHis 中, 构建两株重组 HCV/ E2 重组表达质粒 pRSET#C/ E2 和 pRSET#A/ E2。在诱导表达中 pRSET#A/ E2 的外源基因获得了高效表达, 而 pRSET#C/ E2 的外源基因完全未得到表达。关键词:丙型肝炎病毒; 重组质粒;基因表达中图分类号: R373#2+ 1   文献标识码: A    文章编号: 1005- 5673( 2003) 04- 0019- 05Effect of gene structure of recombine plasmid in HCV/ E2 protein Expression  ZHO U Xu 1, LI Yi-min1, XIA N ing-shao 2  (1. Lanzhou Institute of Biological Products, L anz hou 730046, China; 2. X iamen unireysity , X iamen 36100,China)Abstract: HCV/ E2 gene fragment was obtained from plasmid pUC18/ HCV- E2 by digesting w ith endonuclease BamHI, anotherE2 fragment was obtained from same pladmid by digesting with NcoÑ and HindÓ . Two fragments were inserted into proper read-ing frame of expression vector pRSETHis respectively, and recombiant expression plasmids of pRSET# C/ E2 and pRSET #A/E2were constructed. these recombinant plasmids were transformed into E. coli . TOP10 strain and induced by IPTG. The expres-sive conditions were optimized, the induced purpose protein was detected and analysed by SDS- PAGE and Western- blot. ThepRSET#A/ E2 have a high level expression and the E2 fusion protein accounted for 20% in the total proteins of host bacteriameanwhile the pRSET#C/ E2 have not detected expressive purpose protein entirely. We guess the reason of that is due to a verystable RNA secondar y strcucture within mRNA translation initial region in pRSET#C/ E2.Key words: HCV; Recombinant plasmid ; Gene expression  丙型肝炎病毒( Hepat it is C V irus, HCV)是引起丙型肝炎的主要致病因子,大约 90%的输血后肝炎由HCV 引起, 约有 50% ~ 70%的感染者发展为慢性肝炎,其中又有 10% ~ 20%的慢性携带者最终发展为肝硬化乃至肝癌11, 22。据 1997年WH O的统计数字, 世界范围约有 1. 7亿 HCV 感染者132。丙型肝炎已成为严重威胁人类健康的疾病之一。HCV属黄病毒科, 丙型肝炎病毒属, 是单股正链 RNA 病毒。基因组全长约 9. 4kb,一个大的开放阅读框架( ORF)跨越整个基因组,编码约 3011个氨基酸的前体多肽, 包括 3 个结构蛋白( C、E1、NSl/E2) , 4个非结构蛋白( NS2、NS3、NS4、NS5)。HCV是一种变异率极高的病毒,整个基因组中又以 E1、E2区变异最大。E1、E2基因编码病毒的包膜蛋白。E2区的 N端有分别为 28个和 7个氨基酸的高变区( HVR) , 在不同的分离株中,该区的氨基酸序列差异可达 40% ~ 60% 14, 52。现在普遍接受的观点是 E1、E2区的高变是宿主免疫压力的结果,而病毒正是通过变异来逃避宿主的免疫清除,使感染慢性化16~ 82。正因为如此, 人们推测针对 E1、E2蛋白的抗体可能具有中和作用, HCV 的 E1、E2区受到人们极大的关注。早期的工作证明部分 E2抗体能中和同型病毒, 保护黑猩猩不受同型 HCV 感染19, 102。最近的工作证明 E2蛋白能与人细胞表面抗原CD81特异结合,提出CD81可能是丙型肝炎病毒的细胞受体, HCV 与 CD81的结合可能在介导病毒附着、侵入人体细胞的过程中起关键作用15, 72。因而研究包膜蛋白的抗原变异及宿主免疫应答规律,对H CV 疫苗的研究和开发有重要意义。作者采用原核表达载体 pRSETH is与 HCV/ E2的不同酶切片段分别构建了重组表达质粒 pRSET#C/ E2和 pRSET#A/ E2。pRSET#A/ E2高效表达了HCV/ E2融合蛋白,而 pRSET#C/ E2的H CV/ E2基因完全未表达。19微生物学免疫学进展 2003 年第 31 卷第 4 期                            * 收稿日期: 2003-04- 16作者简介:周  旭( 1963-)女,医学学士,副研究员,主要从事疫苗及分子病毒学研究。材料与方法1  菌种与质粒含H CV/ E2 片段的质粒 pUC18/ E2 由兰州生物制 品研究所第二 研究室保存。表达载 体pRSETHis和宿主菌 T OP10购自 Invitrogen 公司。HCV/ E2抗原由厦门大学夏宁邵教授惠赠。HCV/E2阳性血清为兰州生物制品研究所第二研究室筛选、保存。2  试剂及药品限制 性 内 切 酶、T4DNA lig ase、IPTG 为Promega产品, PVDF 膜购自 Boehringer 公司, 丙烯酰胺和 N、N-甲叉双丙烯酰胺( ACR)购自 Sigma 公司,酵母提取物和蛋白胨购自日本制药株式会社,SDS 为 Merck产品,其他试剂为国产分析纯产品。3  表达质粒的构建3. 1  重组表达质粒 pRSET#C/ E2的构建用 BamH I 酶切含 HCV/ E2 基因的重组质粒pUC18/ E2, 通过低融点琼脂糖回收酶切片段, 获得1196bp的含H CV/ E2 全长基因的片段。根据阅读框架选取 pRSET # C 为表达载体, BamH I 酶切pRSET#C, 低融点琼脂糖回收酶切载体, T 4连接酶将 1193bp的H CV/ E2基因片段克隆到 pRSET#C。通过 Not Ñ + Hind Ó , 酶切筛选出正向连接的重组质粒 pRSET#C/ E2。转化 TOP10受体菌。3. 2  重组表达质粒 pRSET#A/ E2的构建用 Nco Ñ + Hind Ó 酶切含 HCV/ E2基因的重组质粒 pUC18/ E2, 通过低融点琼脂糖回收酶切片段, 获得 1177bp 的含 HCV/ E2 全长基因的片段。根据阅读框架选取 pRSET#A为表达载体, Nco Ñ +H indÓ 酶切 pRSET #A, 低融点琼脂糖回收酶切载体, T4连接酶将 1177bp 的H CV/ E2全长基因克隆到 pRSET#A。得到重组质粒 pRSET#A/ E2。转化T OP10受体菌。4  蛋白表达将表达质粒接种于含 Amp和 Kan的高浓度肉汤培养基中, 37 e 振荡培养过夜。然后以 1B50的比例接种于含 Amp 和 Kan的新鲜培养基中, 37 e 振荡至 OD600值达 0. 8左右,加入终浓度为 1mmo1/ L的 IPTG。37 e 继续培养 4h, 4 e 5000r/ min 离心收集菌体, TES洗涤, 超声波处理裂解,全菌裂解液用于 SDS-PAGE 检查。5  表达蛋白含量测定将诱导培养的全菌体裂解物经 SDS-PAGE后,考马斯亮兰染色, 用 LKB激光扫描仪 550扫描测定含量。6  H CV/ E2阳性血清筛选用 HCV/ E2 抗原包被聚苯乙烯酶标板条( 0. 05mol/ L CBpH9. 6) ,封闭液封闭。加入HCV阳性血清( 20 @ 、40 @ 、80 @、100 @ 稀释) , PBS-T 洗涤,加入HRP-抗人 IgG, PBS-T 洗涤, 加入 TMB底物显色。7  表达产物的蛋白免疫印迹分析(Western-blot)诱导培养的全菌体裂解物经 SDS-PAGE 电泳8h。恒流电转移至 PVDF 膜上。转移后的 PVDF膜于封闭液 ( 0. 1% Tw een20, 0. 1 mo1/ L pH7. 4Tris, 0. 9% NaC1, 20%的 BSA)中 37 e 1. 5 h。加入 100倍稀释的 HCVE2 区抗体阳性血清(采用的HCV/ E2抗原筛选)于 PVDF 膜, 37 e 结合过夜, 用封闭液洗涤 5次; 然后加入 HRP-鼠抗人 IgG, 37 e 1h,洗涤 5次。于显色液中显色 2~ 3 min。结果1  表达质粒与酶切电泳图图 1 表达质粒 pRSET#C/ E2 的 BamHÑ 酶切图Fig11  Expression plasmid pRSET#C/ E2 incised with BamHÑline1: pUC18vector; line2: pUC18/ HCV- E2; line3: incisedpUC18/ HCV- E2;line6: incised pRSET #C/ E2; line7: pRSET#C/ E2; lin8: pRSET#C vector;line4: M arker KDNA EcoRÑ + HindÓ ; M arker pGM E从图 1中可见 BamH I酶切 pUC18/ HCV-E2后的 pU C18载体带和 1193bp 的目的条带;重组质粒pRSET#C/ E2经 BamHI 酶切后的 pRSET#C 载体带和 1193bp的外源基因条带。20                            微生物学免疫学进展 2003 年第 31 卷第 4 期图 2  表达质粒 pRSET#A/ E2的 NcoÑ + HindÓ 酶切图Fig. 2 Expression plasmid pRSET#A/ E2 incisedw ith NcoÑ and HindÓline1: pRSET# A vector; line2: pRSET# A/ E2; line3: incisedpRSET#A/ E2;line6: incised pUC18/ HCV- E2; line7: pUC18/ HCV- E2;line8: pUC18 vector;line4: M arker pGEM ; line5 : M arker KDNA EcoRÑ + HindÓ  从图 2中可见经 Nco Ñ + Hind Ó 酶切 pUC18/HCV-E2后的 pUC18载体带和 1177bp的目的条带1重组质粒 pRSET#A/ E2的 Nco Ñ + Hind Ó 酶切后的 pRSET#A载体带和 1193bp的外源基因条带。2  表达产物的 SDS-PAGE电泳图培养诱导后的 SDS-PAGE 电泳结果显示重组质粒 pRSET#C/ E2未见明显的新增条带。在重组质粒 pRSET#A/ E2的电泳图中,见一明显的新增条带,分子量约 48kD(目的蛋白 43kD 及载体蛋白 4.8kD)。(见图 3)3  pRSET#A/ E2表达蛋白含量测定重组质粒 pRSET #A/ E2 外源基因表达量达菌体蛋白总量的 18%。(见图 4)4  表达产物的蛋白免疫印迹(Western-blot)重组质粒 pRSET #A/ E2 表达产物的 Western-blot结果表明,表达目的蛋白具有 H CV/ E2蛋白抗原活性。(见图 5)图 3  表达产物的 SDS- PAGE电泳分析F ig. 3  0. 1% SDS- 15% PAGE analysis of expressed proteinL inel: pRSET#C; line2& 3: pRSET#C/ E2; line5: pRSET#A; 1in6& 7& 8: pRSET#A/ E2L ine4: standard protein M W: 55 000, 43 000, 31 000, 21 000, 14 000( Dalton)图 4  pRSET#A/ E2 表达产物的密度扫描分析F ig. 4 Density scanning analysis of expressed proteinsin SDS- PAGE( 550nm)讨论作者在重组表达H CV/ E2蛋白时, 选用了原核融合蛋白表达载体 pRSETH is, 该载体能高效表达融合蛋白,同时其含有 6个 His的纯化标签, 便于表达蛋白的纯化。本室保存的重组质粒 pUC18/HCV-E2 是通过 Sm aI 位点 T-A 克隆的方法构建的,插入的H CV/ E2基因片段( 1215bp)中的 5. 端带有部分 HCV/ E1 基 因 ( 155bp )。为了 避免将pU C18/H CV-E2中的载体基因带入重组表达质粒中,并力图使插入的H CV/ E2基因接近表达载体的起始密码子, 利用了 pU C18/H CV-E2 的 E1残基中的 BamHI( 1354)与 pUC18中的 BamHI 位点,酶切21微生物学免疫学进展 2003 年第 31 卷第 4 期                            图 5 pRSET#A/ E2 表达产物的Western-blot分析F ig. 5 Western- blot analysis o f expressedprotein by pRSET#A/ E2A : Blotting membrane stained with amido blackL ine1: ysates o f pRSET#A; line2: 1ysates o f pRSET#A/ E2;B: W estern- blot ; line3: 1ysates o f pRSET #A/ E2; line4: 1ysatesof pRSET#A获得包含 H CV/ E2 全长基因的 1196bp 片段, 正向插入表达载体 pRSET#C中构建了 pRSET#C/ E2。但在培养诱导中 pRSET#C/ E2 的外源基因未得到表达。继而利用 pU C18/H CV-E2 中 E1 残基中的NcoI( 1429)酶切位点与 pUC18中的 H indIII 位点,酶切获得包含 HCV/ E2全长基因的 1177bp 片段,插入表达载体 pRSET#A 中构建 pRSET#A/ E2。该表达质粒在培养诱导中高效表达了外源基因 HCV.E2。通过分析 pUC18/HCV-E2 的基因测序结果,排除了因基因缺失、突变等造成读码错误致使翻译障碍所导致的 pRSET#C/ E2外源基因无法表达的可能。同时确认阅读框架无误。比较两种表达载体翻译起始端的 RNA二级结构,发现 pRSET#C/ E2的载体融合蛋白区基因与插入外源基因 HCV/ E2 中 E1 残基5. 端的 83个碱基形成了包含 190个碱基的二级结构(见图6) ,由于该二级结构非常稳定,使得翻译不能有效起始,这可能是 pESET#C/ E2外源基因不能表达的原因。而 pRSET#A/ E2中的HCV/ E2基因片段切掉了 E1残基 5. 端的 82 个核苷酸,破坏了此二级结构的形成,因而得到了高效表达。在选择表达载体时,插入的外源基因 5. 端能否与载体部分形成二级结构,对于表达的成功与否可能非常重要, 同时应尽量减少外源基因 5. 端非目的基因序列。图 6  表达质粒 pRSET#C/ E25. 端二级结构分析F ig. 6 mRNA second structure of 5.- end of pRSET#C/ E21~ 107bp: Fusion protein gene region; 108~ 190bp: 5.- end of E1 gene参考文献:112 Choo QL, Kuo G, W einer AJ, et al. Isolation of a cDNA clone de-rived from a blood-borne non-A, non-B viral hepat it is genome1J2.Science 1989, 244: 1-3.122 Kato N, Hijikato M , Octsyama Y, et al. M olecular clon ing of thehuman hepatit is C virus genome f rom Japanese pat ients with non22                            微生物学免疫学进展 2003 年第 31 卷第 4 期- A, non B hepat it is1J2 . Proc Nat1 Acad S ci U SA 1990, 87:9524-9528.132 Pileri P, Uematsu Y, Campagnoli S , et al. Binding of hepat it is Cvirus to CD811J2. S cience 1998, 282: 938-941.142 增蔚蓝,阮  力.中国人丙型肝炎病毒膜蛋白和非结构蛋白区1( E1, E2/ NS 1)的基因克隆和序列分析1 J2. 病毒学报 1992,12: 360-363.152 李  兵.丙型肝炎病毒分子生物学与基因疫苗1J2.国外医学病毒学分册 1999, 6: 102-104.162 W einer A J , Geysen H M, Ch ristphorson C, et al. Eviden ce forimmune selection of hepatit is C virus ( HCV) putative envelopeglycoprotein variants: Potent ial role in chronic HCV infect ions1J2.Proc Nat1 Acad Sci USA 1992, 89: 3468- 3472.172 S himizu Y K, Hijikata M , lw amoto A, et al. 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Proc Nat1 Acad Sci US A 1994, 9 1: 7792-7796.欢迎订阅5细胞与分子免疫学杂志65细胞与分子免疫学杂志6由中国免疫学会和第四军医大学共同主办,是全国惟一与细胞和分子生物学相关的免疫学专业性杂志, 系我国中文核心期刊、科技论文统计源期刊、美国5CA6、5IM6及 M EDLINE 等刊源。该刊的主要栏目有基础研究、临床研究、抗体工程、技术方法、综述和信息等,主要报道我国生物学领域细胞与分子免疫学方面的理论及应用研究成果。欢迎生物学的基础和医学临床工作者投稿并订阅。该刊为双月刊(逢单月出版) ,国际标准开本( A4) 128页,信息量大。彩图随文, 铜版纸印刷精装。单价á 15 元,全年 90 元。国内外公开发行, 邮发代号 52-184。欢迎广大读者到当地邮局或单位收发室订购。联系地址: 陕西省西安市第四军医大学校内5细胞与分子免疫学杂志6编辑部联系电话: 029- 3374550或军线 0901- 74550    邮编: 710032Email: immuedit@ fmmu. edu. cn23微生物学免疫学进展 2003 年第 31 卷第 4 期                            

重组质粒二级结构对丙型肝炎病毒E2蛋白基因表达的影响

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21230/%e9%87%8d%e7%bb%84%e8%b4%a8%e7%b2%92%e4%ba%8c%e7%ba%a7%e7%bb%93%e6%9e%84%e5%af%b9%e4%b8%99%e5%9e%8b%e8%82%9d%e7%82%8e%e7%97%85%e6%af%92E2%e8%9b%8b%e7%99%bd%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e8%a1%a8%e8%be%be%e7%9a%84%e5%bd%b1%e5%93%8d.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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