目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对不同增殖结肠癌细胞系的生长抑制作用,以及对低氧诱导因子(HIF-1α)表达的抑制作用。方法:采用体外培养属于结肠癌DukesC期的HCT-8细胞和LOVO细胞,不同浓度的全反式维甲酸(ATRA)干预。利用MTT观察ATRA对结肠癌细胞系的生长,采用半定量RT-PCR和Western印迹检测ATRA干预后在低氧状态下结肠癌细胞中HIF-1α的表达。结果:全反式维甲酸(ATRA)对结肠癌细胞的增殖有抑制作用,对不同增殖能力的结肠癌细胞HIF-1α的表达量有抑制作用。结论:全反式维甲酸可以抑制结肠癌细胞的增殖,对结肠癌细胞HIF-1α的表达有明显的抑制作用

冯子杰

吴媛

殷平

田瑞华

郑良楷

金光辉

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［文章编号］ 1000 － 4718( 2010) 07 － 1416 － 04［收稿日期］2009 － 11 － 16 ［修回日期］2010 － 03 － 05* ［基金项目］厦门市科技局基金资助项目( No． 3502Z20074019)△通讯作者 Tel: 0592 － 2993342; E － mail: yinping20022002@ yahoo． com． cn全反式维甲酸对不同增殖潜能的结肠癌细胞株 HIF － 1α表达的影响*田瑞华1， 殷 平1△， 金光辉2， 冯子杰2， 吴 媛2， 郑良楷3( 1 福建医科大学教学医院 － 厦门大学附属中山医院病理科，福建 厦门 361004 ; 2厦门大学医学院基础医学部实验室，福建 厦门 361006; 3厦门市妇幼保健院病理科，福建 厦门 361003)［摘 要］ 目的: 探讨全反式维甲酸( ATRA) 对不同增殖结肠癌细胞系的生长抑制作用，以及对低氧诱导因子( HIF － 1α) 表达的抑制作用。方法: 采用体外培养属于结肠癌 Dukes C 期的 HCT － 8 细胞和 LOVO 细胞，不同浓度的全反式维甲酸( ATRA) 干预。利用 MTT 观察 ATRA 对结肠癌细胞系的生长，采用半定量 RT － PCR 和 Western印迹检测 ATRA 干预后在低氧状态下结肠癌细胞中 HIF － 1α 的表达。结果: 全反式维甲酸( ATRA) 对结肠癌细胞的增殖有抑制作用，对不同增殖能力的结肠癌细胞 HIF － 1α 的表达量有抑制作用。结论: 全反式维甲酸可以抑制结肠癌细胞的增殖，对结肠癌细胞 HIF － 1α 的表达有明显的抑制作用。［关键词］ 低氧诱导因子 － 1α; 维甲酸; 结肠肿瘤［KEY WORDS］ Hypoxia － inducible factor － 1α; Retinoic acid; Colonic neoplasms［中图分类号］ R363 ［文献标识码］ A doi: 10． 3969 / j． issn． 1000 － 4718． 2010． 07． 036维甲酸( retinoic acid，RA) 又称视黄酸或维生素 A 酸，是维生素 A 的衍生物。机体内一定浓度的维甲酸可调节细胞的增殖、分化、成熟，是机体正常生长发育和各种生理活动必不可少的重要因子，在恶性肿瘤的发生与治疗方面也有重要的作用。RA 由胃肠道吸收后经氧化形成全反式维甲酸( all－ trans retinoic acid，ATRA) ，通过单纯弥散进入细胞。ATRA 在改善 p53 以及相关下游基因的水平上，有明显的作用［1 － 3］。ATRA 也促进泛素连接酶 E3 水平的提高［4］，是诱导白血病细胞分化中的一个重要途径。这些研究表明，p53 和相关下游基因的转导途径以及泛素连接酶 E3 信号转导途径，均可以受到 ATRA 药物的影响而发生改变。低氧诱导因子 － 1 ( hypoxia inducible factor 1，HIF － 1 ) 是迄今为止发现唯一的特异性低氧状态下发挥活性的转录因子［5］。HIF － 1α 是 HIF － 1 所独有的氧调节蛋白，也是 HIF －1 的可调节亚基［6］。Sutton 等［7］在肾脏的缺血再灌注损伤模型中发现 p53 对 HIF － 1α 合成具有负向的调控机制。Oda等［8］在前列腺癌肿瘤标记物巨噬细胞移动抑制因子( MIF) 的研究中，也发现 MIF 通过了依赖野生型 p53 的途径，调控了HIF 合成的过程。另一方面，在泛素连接酶诱导的细胞分化途径中，正常氧浓度时，HIF － 1α 能够与泛素连接酶 ( E3 )VHL 结合，导致 HIF － 1α 发生羟基化而被泛素化降解［9］。本研究拟对 2 个低氧环境中生长的结肠癌细胞系进行全反式维甲酸的干预，采用 MTT、RT － PCR 及 Western blotting法，观察癌细胞的生长和 HIF － 1α 的表达变化，探讨 ATRA抑制结肠癌细胞 HIF － 1α 表达及其抑制结肠癌细胞增殖的可能性。材 料 和 方 法1 材料1． 1 主 要 试 剂 ATRA 购 自 Sigma。MTT 购 自 Amresco。DMSO 购自 Sigma。DMEM、RPMI － 1640 细胞培养液、胰蛋白酶 － EDTA、小牛血清均购自 Hyclone; 总 RNA Trizol 抽提试剂盒购自 Invitrogen，逆转录试剂盒以及 PCR 试剂盒( 含 DL2000marker) 均购自 TaKaRa。总蛋白浓度测试试剂盒购自 Pierce。HRP 标记的羊抗兔 IgGⅡ抗购自 Invitrogen，β － actin 抗体购自 Bethyl。HIF － 1α 抗体由福州迈新代购自 Thermo。1． 2 细胞培养及药物干预 结肠腺癌细胞株 HCT － 8 细胞以及 LOVO 细胞，购于厦门闽博生物技术有限公司。DMEM细胞培养液和胰蛋白酶 － EDTA 购于 Gibco，小牛血清购于Hyclone。癌细胞接种于培养板上，在含有 5% CO2、95% O2、37 ℃饱和湿度条件下的培养箱中培养，HCT － 8 细胞用 RPMI－ 1640 培养液( 含 10%小牛血清、1 × 105 U /L 青霉素、1 × 105U /L 链霉素) ，LOVO 细胞用 DMEM 培养液( 含 10% 小牛血清、1 × 105 U /L 青霉素、1 × 105 U /L 链霉素) 培养。ATRA 的浓度分组如下: ATRA 的工作浓度分别为 10 －7 mol /L( 低浓度组) 、10 －6 mol /L( 中浓度组) 和 10 －5 mol /L( 高浓度组) ，以 AT-RA 粉剂溶解于培养液中使用。设立空白对照组，其中空白对照组未经任何处理，仅加入与 ATRA 实验组等量培养液。各组·6141· 中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2010，26( 7) : 1416 － 1419细胞反复传代，取生长状态良好的细胞用于实验。细胞进入对数生长期后，将培养皿置于 10% O2 的环境内 8 h。经过不同浓度的 ATRA 干预和 8 h 的低氧环境培养后进行实验。2 方法2． 1 MTT 观察细胞生长状况 2 株结肠癌细胞分组为 10 －7mol /L( 低浓度组) 、10 －6 mol /L( 中浓度组) 、10 －5 mol /L( 高浓度组) 、空白对照组和培养液组。处于对数生长期时，均以3 × 103 cells /well 的密度接种于 96 孔板中，每组为 6 个复孔。加药组培养 12 h 后加入 10 －7 mol /L、10 －6 mol /L、10 －5 mol /LATRA，培养 24 h 后加入显色剂 MTT 以及 DMSO，设置培养液对照以及调零孔。每孔加入 MTT( 0. 5 g /L) 100 μL，孵育 4 h，加入二甲基亚砜( DMSO) 100 μL /well，作用 30 min，用酶标仪检测 490 nm 波长下每孔细胞吸光度( A) 值，每组 6 个复孔取平均值。按下列公式计算细胞生长抑制率: 抑制率( % ) = ( 1－ 实验组平均 A 值 /对照组平均 A 值) × 100%。连续培养 4d，制作 2 种细胞系的生长曲线。2． 2 RT － PCR 检测 结肠癌细胞株 HCT － 8、LOVO 细胞分别设培养液对照组和不同浓度的 ATRA 实验组。培养细胞长满 80% 皿底面积时，去除含血清培养液，用不含血清的培养液洗 3 次，离心收集细胞后，去除上清 PBS 液。沉淀加入 1mL Trizol 液和 200 μL 氯仿，手中振荡数秒，静置 2 min。4 ℃下 13 000 r /min 离心 10 min，取上清。加入 0. 5 mL 异丙醇，轻轻混匀。静置 10 min。4 ℃下 13 000 r /min 离心 10 min，去除上清。加入 1 mL 75% 乙醇( DEPC 水配兑) 轻轻洗涤。最后 4 ℃下 7 500 r /min 离心 5 min，去上清。晾干，加入 20 μLDEPC 水溶解。放入 － 20 ℃ 保存。测定浓度及 260 /280 nm的吸光度( A) 值定量后，取总 RNA 2 μg 作 20 μL 反应体系逆转录。实验按说明书逆转录合成 cDNA，反应体系如下: 模板RNA 2 μL，oligo 随机引物 1 μL，dNTP 4 μL，DEPC 水 3 μL，65 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，5 × reaction buffer 4 μL，RNA inhibitor0. 5 μL，逆转录酶 0. 5 μL，DEPC 水 5 μL。37 ℃ 5 min( 模板与引物退火) →42 ℃ 60 min( cDNA 合成) →70 ℃ 15 min( 反转录酶灭活) →4 ℃ 5 min。获得逆转录产物( cDNA) ，－ 20℃冰箱保存备用。取 1 μL 逆转录产物为模板，以 25 μL 反应体系进行PCR 扩增。引物序列: human β － actin 上游 5' － GGCACCA-CACCTTCTACAAT － 3'，下 游 5' － TCTCCTTAATGTCACG-CACGAT － 3'。产物长度为 460 bp 左右; HIF － 1α 上游 5' －CACCATTAGAAAGCAGTTCCG － 3'，下 游 5' － GGCTGTC-CGACTTTGAGTAT － 3'，产物长度为 740 bp 左右。DNA mark-er 片段为 250 － 750 bp。PCR 反应参数分别为: ( 1) 目的 HIF － 1α: 94 ℃ 5 min 预变性，94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，23 个循环，最后 72 ℃10 min; ( 2) 内参照 β － actin: 退火 56 ℃ 30 s。电泳分析: 分别取目的产物和内参产物与 loading buffer 混匀后在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，采用 Innotech 凝胶图像分析系统扫描，并分析电泳条带，测定目的条带的吸光度比值( AA ) 以及内参条带 β － ac-tin 吸光度值( AB ) ，以吸光度比值( HIF －1α 基因条带吸光度值 /β － actin 基因条带吸光度值) ，即( AA × S) / ( AB × s) ( S 与 s 分别表示条带的面积) 代表对应 mRNA 的表达量，半定量分析。2． 3 Western blotting 检测蛋白表达 当细胞进入对数生长期后，将培养皿置于 O210% 的环境内 8 h。经过以上 ATRA干预和低氧环境培养后，收集细胞提取蛋白，离心去除上清PBS 液，沉淀加入蛋白裂解液 RIPA 200 μL，以及蛋白酶抑制剂 PMSF。剧烈振荡，冰上放置 1 h，4 ℃下 13 000 r /min 离心10 min，将上清转移至 1. 5 mL EP 管，各组取等量待测蛋白质样本，按照 1 ∶ 50 比 例 稀 释 样 品。测 量 总 蛋 白 浓 度。放 入－ 20 ℃保存。然后取各组蛋白提取液，加入 4 × 上样 buffer混合煮沸 5 min 后上样。12% SDS － PAGE 电泳，转膜、0. 5%脱脂奶粉封 闭 1. 5 h、分 别 加 入 HIF － 1α ( 1 ∶ 400 ) 抗 体 和βactin ( 1∶ 500) 抗体，4 ℃过夜，洗膜，分别加入 1∶ 1 000 鼠抗HRP，孵育2 h，在暗室中进行 ECL 染色，X 胶片曝光、显影和定影，图像分析系统扫描，并分析电泳条带，以吸光度比值表示蛋白的表达量( 即各条 HIF － 1α 蛋白条带吸光度 /β － actin 条带吸光度) 。半定量分析不同浓度 ATRA 下的 HIF －1α表达。3 统计学处理采用 SPSS 13． 0 软件整理分析数据，方差分析比较各组间的差异。计量资料数据以均数 ± 标准差( 珋x ± s) 表示。结 果1 ATRA 干预后 HCT －8 细胞和 LOVO 细胞形态学改变2 株细胞均呈上皮样贴壁依赖性生长，其中 HCT － 8 细胞胞核大而圆，居中，胞浆丰富，透光度大，折光性一般，轮廓清晰，形态为不规则星芒形、梭形。胞膜呈枝桠状贴壁延伸，贴附性良好，聚堆现象明显，生长快。ATRA 干预后，星芒形减少，梭形增多，胞膜呈现毛刺状生长。而 LOVO 细胞胞核大而圆，居中，胞浆透光度和折光度一般，轮廓清晰，形状为不规则多角形、梭形，贴附性良好，聚堆现象不明显，生长较快。ATRA 干预后，细胞形态呈短梭形增多，胞膜外缘出现毛刺状生长。2 体外细胞增殖抑制实验ATRA 作用的结肠癌细胞株 HCT － 8 和 LOVO 与对照组比较有一定差别。ATRA 处理 1 d、2 d、3 d 和 4 d 后，细胞增殖明显受到抑制。浓度越高细胞增殖抑制现象越明显，见图 1。3 RT － PCR 检测 ATRA 干预后 HCT －8 和 LOVO 细胞的HIF －1α mRNA 表达RT － PCR 检测结果如图 2 所示，2 种细胞的 HIF － 1 αmRNA 表达与空白对照组比较均明显降低，2 种细胞 HIF －1α 受抑制的水平随着 ATRA 药物的浓度升高而下降( P ＜0. 05) 。并且，HCT － 8 细胞的 HIF － 1α mRNA 表达比 LOVO细胞的表达降低更明显，见图 2。4 Western 印迹检测 ATRA 干预后 HCT －8 与 LOVO 细胞的 HIF －1α蛋白表达ATRA 干预后，2 种细胞的 HIF － 1α 蛋白表达与空白对照组相比较明显降低，差异显著( P ＜ 0. 05 ) ，2 株细胞 HIF －1α 蛋白受抑制的水平随着 ATRA 药物的浓度升高而下降( P＜ 0. 05) ，并且 LOVO 细胞 HIF － 1α 蛋白表达被抑制程度比HCT － 8 细胞更明显，见图 3。·7141·Figure 1． MTT assay for HCT － 8 and LOVO cell growth afterATRA treatment． After treating with ATRA for 1 d，2d，3 d and 4 d，the cell proliferation was significantlyinhibited，and the inhibition effect was correlated withATRA concentration． ATRA ( 10 －5 mol /L ) ，ATRA( 10 －6 mol /L) ，ATRA( 10 －7 mol /L) : Cells were trea-ted with 10 －7 mol /L，10 －6 mol /L and 10 －5 mol /L AT-RA，respectively． No ATRA control: only culture me-dium without ATRA． Medium: only solution withoutcells．图 1 HCT －8 以及 LOVO 细胞的 MTT 生长曲线Figure 2． HIF － 1α transcription levels of HCT － 8 and LOVOcells after treated with different concentrations of AT-RA． 珋x ± s． n = 5． * P ＜ 0. 05 vs control． HIF － 1α mR-NA levels were determined by RT － PCR and grayscale analysis． Cells were treated with 10 －7 mol /L，10 －6 mol /L and 10 －5 mol /L ATRA，then the mRNAlevels were compared with non － treated controls． Lane1: non － treated control; Lane 2 － 4: cells treatedwith 10 －7 mol /L，10 －6 mol /L and 10 －5 mol /L ATRA．图 2 不同浓度 ATRA 干预后 HCT － 8 细胞与 LOVO 细胞的 HIF －1α mRNA 的表达Figure 3． HIF － 1α expression levels of HCT － 8 and LOVOcells after treated with different concentrations of AT-RA． 珋x ± s． n = 5． * P ＜ 0. 05 vs control． HIF － 1αprotein levels were determined by Western blottingand gray scale analysis． Cells were treated with 10 －7mol /L，10 －6 mol /L and 10 －5 mol /L ATRA，then theprotein levels were compared with non － treated con-trols． Lane 1: non － treated control; Lane 2 － 4: cellstreated with 10 －7 mol /L，10 －6 mol /L and 10 －5 mol /LATRA，respectively．图 3 不同浓度 ATRA 干预后 HCT － 8 细胞与 LOVO 细胞的 HIF －1α蛋白的表达．讨 论细胞内对 HIF － 1 的调控主要通过其 α 亚基进行。低氧诱导因子 － 1 ( HIF － 1 ) 通过与低氧反应元件 ( hypoxic re-sponse element，HRE) 结合，引发下游基因的转录。目前已知受 HIF 调控的基因有 150 余种，包括诱导型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase，iNOS) ［10］ 和血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor，VEGF) ［11］等，以上基因的大量表达，可以促进肿瘤血管再生和细胞能量代谢加强，通过提高糖酵解速率和多血管生成对低氧环境的适应，使得肿瘤得以生长和转移。由于 HIF － 1 基因在肿瘤细胞中特异性表达和介导肿瘤细胞生长特性，调节 HIF － 1 水平可以作为肿瘤治疗手段，近年来成为肿瘤基因治疗的新靶点。有学者发现［12］，在结直肠腺癌中，HIF － 1α 的表达水平从腺瘤到腺癌病变中不断增高。HIF － 1α mRNA 在部分结直肠腺瘤及大部分腺癌中呈过度表达，提示细胞低氧出现在癌变发生之前并持续到肿瘤发展全过程。有淋巴结转移或远处转移( 主要为 肝 转 移) 的 Dukes C /D 期 患 者 HIF － 1α 的 mRNA、VEGF、MVD 显著高于 Dukes A、B 期，也提示 HIF － 1α 参与了结直肠腺癌的侵润和转移。HIF － 1α 过表达在 90 % 以上的结肠癌中被检测到，然而在相应的正常组织中却没能检测到HIF － 1α 的表达［13］。Zhang 等［14］最近发现，在 ATRA 治疗急性粒细胞性白血病的过程中，不仅在 RNA 水平上 HIF － 1 参与了肿瘤细胞的诱导分化，并且在采用 shRNA 干扰 HIF － 1α·8141·和 HIF － 1β 后，HIF － 1α 表达的蛋白依然通过非转录机制参与 ATRA 对肿瘤细胞的诱导分化。特别在 ATRA 治疗的过程中，HIF － 1α 的表达也扮演了重要的角色。本研究中，我们体外培养 2 种细胞，均为结肠癌 Dukes C期细胞，其中 LOVO 细胞为原发灶在回盲部的癌细胞。观察2 种细胞在物理低氧条件下的生长情况，以及各自的 HIF －1α 表达，并使用不同浓度的 ATRA 干预后，观察到 HIF － 1α表达受到不同程度的抑制。在转录水平上，我们通过 RT －PCR 实验证明 2 株体外培养的细胞表达 HIF － 1α 受到干预后表达明显降低，并且与 ATRA 的浓度呈正比。HCT － 8 细胞在 HIF － 1α mRNA 表达量上比 LOVO 细胞受到 ATRA 干预的影响更明显。在翻译水平上，我们通过 Western 印迹实验证明 2 株细胞表达的 HIF － 1α 受到干预后表达也有降低，但是 HCT － 8 细胞降低的程度较 LOVO 为小。我们的研究通过形态学、生长曲线的增殖抑制实验、转录与翻译 2 个水平的分子生物学方法表明，ATRA 可以明确抑制结肠癌细胞在低氧环境下的 HIF － 1α 表达，并且抑制的程度与药物的浓度呈正比。其中在 HIF － 1α 因子表达的转录水平上，HCT － 8 细胞受到的抑制比 LOVO 更多，在翻译水平上，HCT － 8 细胞受抑制的程度比 LOVO 更少，其中的机制，尚待进一步探索阐明。［参 考 文 献］［1］ 李良平，张 正，韩盛玺． 维甲酸对人肝癌细胞转化生长因子 β1 基因及蛋白水平的影响［J］． 中华肝脏病杂志，2001，12( 9) : 367 － 368．［2］ Nakashima T，Sun SY，Lotan R，et al． All － trans － retin-oic acid enhances the effect of adenovirus － mediated wild－ type p53 gene transfer in head and neck squamous cellcarcinoma［J］． Laryngoscope，2001，111 ( 8 ) : 1459 －1464．［3］ Pepper C，Ali K，Thomas A，et al． Retinoid － inducedapoptosis in B － cell chronic lymphocytic leukaemia cellsis mediated through caspase － 3 activation and is inde-pendent of p53，the retinoic acid receptor，and differentia-tion［J］． Eur J Haematol，2002，69( 4) : 227 － 235．［4］ Baxter SS，Carlson LA，Mayer AM，et al． Granulocyticdifferentiation of HL － 60 promyelocytic leukemia cells isassociated with increased expression of Cul5［J］． In VitroCell Dev Biol Anim，2009，45( 5 － 6) : 264 － 274．［5］ Semenza G，Wang GL． A nuclear factor induced by hy-poxia via de novo protein synthesis binds to the humanerythropoietin gene enhancer at a site required for tran-scriptional activation［J］． Mol Cell Biol，1992，12( 12) :5447 － 5454．［6］ Song LP，Zhang J，Wu SF，et al． Hypoxia － induciblefactor － 1 alpha － induced differentiation of myeloid leuke-mic cells is its transcriptional activity independent［J］．Oncogene，2008，27( 12) : 519 － 527．［7］ Sutton TA，Wilkinson J，Mang HE，et al． p53 regulatesrenal expression of HIF － 1α and pVHL under physiologi-cal conditions and after ischemia － reperfusion injury［J］．Am J Physiol Renal Physiol，2008，295 ( 6 ) : F1666 －F1677．［8］ Oda S，Oda T，Nishi K，et al． Macrophage migration in-hibitory factor activates hypoxia － inducible factor in a p53－ dependent manner［J］． PLoS One，2008，3 ( 5 ) :e2215．［9］ Bruick RK，Mcknighy SL． A conserved family of prolyl －4 － hydroxylases that modify HIF［J］． Science，2001，294( 5545) : 1337 － 1340．［10］ 殷 平，李 才，孙 波，等． 不同增殖能力结肠癌细胞株 iNOS mRNA 表达的比较研究［J］． 中国病理生理杂志，2004，20( 5) : 883 － 886．［11］ 殷 平，王效民，王 斌，等． 全反式维甲酸对结肠癌不同增殖潜能细胞株 VEGF 表达的影响［J］． 中国病理生理杂志，2006，22( 11) : 2198 － 2201．［12］ 樊利芳，刁路明． 低氧诱导因子 － 1α 在结直肠腺癌中的表达及意义［J］． 中华病理学杂志，2004，6 ( 33 ) :242 － 246．［13］ Lee JW，Bae SH，Jeong JW，et al． Hypoxia － induciblefactor alpha ( HIF － 1) : its protein stability and biologicalfunctions ［J］． Exp Mol Med，2004，36( 1) : 1 － 12．［14］ Zhang J，Chen GQ． Hypoxia － HIF － 1 alpha － C /EBP al-pha /Runx1 signaling in leukemic cell differentiation［J］．Pathophysiology，2009，16( 4) : 297 － 303．·9141·

全反式维甲酸对不同增殖潜能的结肠癌细胞株HIF-1α表达的影响

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/18537/%e5%85%a8%e5%8f%8d%e5%bc%8f%e7%bb%b4%e7%94%b2%e9%85%b8%e5%af%b9%e4%b8%8d%e5%90%8c%e5%a2%9e%e6%ae%96%e6%bd%9c%e8%83%bd%e7%9a%84%e7%bb%93%e8%82%a0%e7%99%8c%e7%bb%86%e8%83%9e%e6%a0%aaHIF-1%ce%b1%e8%a1%a8%e8%be%be%e7%9a%84%e5%bd%b1%e5%93%8d.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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