Monoterpenes and their monoterpenoid derivatives form a subclass of terpene(oid)s. They are widely used in medicines/pharmaceuticals, as flavor and fragrance compounds, or in agriculture and are also considered as future biofuels. However, for many of these substances, the extraction from natural sources poses challenges such as occurring at low concentrations in their raw material or because the natural sources are diminishing. Furthermore, many of the structurally more complex terpenoids cannot be chemically synthesized in an economic way. Therefore, microbial production provides an attractive alternative, taking advantage of the often distinct regio- and stereoselectivity of enzymatic reactions. However, monoterpenes and monoterpenoids are challenging products for industrial biotechnology processes due to their pronounced cytotoxicity, which complicates the production in microorganisms compared to longer-chain terpenes (sesquiterpenes, diterpenes, etc.).
The aim of this thesis was to generate a biotechnological complement to fossil-resources-based chemical processes for industrial monoterpenoid production. Therefore, a starting point for the further development of a microbial cell factory based on the microbe Pseudomonas putida KT2440 was aimed to be created. This production organism should be able to conduct a whole- cell biocatalysis to selectively oxyfunctionalize monoterpene hydrocarbons using renewable industrial by-products and waste streams as raw material for monoterpenoid production (Figure 1). As a model substance, the production of (-)-menthol should be addressed due to its industrial significance. (-)-Menthol is one of the world’s most widely-used flavor and fragrance compounds by volume as well as a medical component, having an annual production volume of over 30,000 tons. An approach for (-)-menthol production from renewable resources could be a biotechnological(-chemical) two-step conversion (Figure 1), starting from (+)-limonene, a by-product of the citrus fruit processing industry.
The thesis project was divided into three parts. In the first part, enzymes (limonene-3- hydroxylases) were to be identified that can convert (+)-limonene into the precursor of (-)-menthol, (+)-trans-isopiperitenol. To counteract product toxicity, in the second part, the tolerance of the intended production organism P. putida KT2440 towards monoterpenes and their monoterpenoid derivatives should be increased. Finally, in the third part, the identified hydroxylase enzymes would be expressed in the improved P. putida KT2440 strain to create a whole-cell biocatalyst for the first reaction step of a two-step (-)-menthol production, starting from (+)-limonene.
To achieve these objectives, different genetic/molecular biology and analytical methods were applied. In this way, two cytochrome P450 monooxygenase enzymes from the fungi Aureobasidium pullulans and Hormonema carpetanum could be identified and functionally expressed in Pichia pastoris, which can catalyze the intended hydroxylation reaction on (+) limonene with high stereo- and regioselectivity. A further characterization of the enzyme from A. pullulans showed that apart from (+) limonene the protein can also hydroxylate ( ) limonene, - and -pinene, as well as 3-carene.
Furthermore, within this thesis, mechanisms of microbial monoterpenoid resistance of P. putida could be identified. It was shown that the different monoterpenes and monoterpenoids tested have very different toxicity levels and that mainly the Ttg efflux pumps of P. putida GS1 are responsible for the tolerance to many of these compounds. Based on these results, a P. putida KT2440 strain with increased resistance to various monoterpenoids, including isopiperitenol, could then be generated, which can be used as a host organism for the further development of monoterpenoid-producing cell factories.
While within the scope of this work the heterologous expression of the fungal gene in prokaryotic cells in a functional form could not be realized despite different approaches, the identified enzymes, the monoterpenoid-tolerant P. putida strain and a plasmid developed for heterologous gene expression in P. putida provide a starting point for the further design of a microbial cell factory for biotechnological monoterpenoid production.Monoterpene und ihre Monoterpenoid-Derivate bilden eine Unterklasse der Terpen(oid)e und finden eine breite Anwendung als Duft- und Aromastoffe, Arzneimittelbestandteile, in Kosmetika und als Agrochemikalien. Seit einigen Jahren wird aber auch ein möglicher Einsatz als zukünftige Biokraftstoffe diskutiert. Für viele dieser Substanzen birgt die Extraktion aus natürlichen Quellen, wie etwa Pflanzenteilen, jedoch einige Herausforderungen, wie z. B. eine sehr geringe Konzentration im Ausgangsmaterial oder die Tatsache, dass die benötigten Pflanzen immer weniger verfügbar sind. Während für einige Monoterpene und Monoterpenoide inzwischen chemische Herstellungsverfahren entwickelt werden konnten, ist es besonders für strukturell komplexere Moleküle immer noch schwierig oder sogar unmöglich, diese wirtschaftlich chemisch zu synthetisieren. Deshalb bietet die biotechnologische Herstellung mit Mikroorganismen eine attraktive Alternative. Eine der großen Herausforderung bei der Biosynthese einiger Monoterpenoide ist jedoch ihre ausgeprägte Zytotoxizität, welche die Herstellung von Monoterpenen und Monoterpenoiden in Mikroorganismen erschwert.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine biotechnologische Ergänzung zu den auf fossilen Rohstoffen basierenden, chemischen Prozessen für die industrielle Monoterpenoid-Produktion zu schaffen. Dafür sollte die Grundlage für die weitere Entwicklung einer mikrobiellen Zellfabrik auf Basis des Bakteriums Pseudomonas putida KT2440 generiert werden. Der Produktionsorganismus sollte selektiv Monoterpenkohlenwasserstoffe oxygenieren und dafür erneuerbare industrielle Abfallströme als Ausgangsstoffe für die Monoterpenoid-Produktion nutzen können (Abbildung 1). Als Modellsubstanz sollte die Herstellung von (-) Menthol realisiert werden, das wegen seiner industriellen Bedeutung als einer der weltweit meist genutzten Duft- und Aromastoff sowie seines Einsatzes als medizinischer Bestandteil ausgewählt wurde. Ein Ansatz für ein ( ) Menthol-Produktionsverfahren aus erneuerbaren Rohstoffen könnte eine biotechnologische( chemische), zweistufige Umwandlung ausgehend vom Nebenprodukt der Zitrussaft-Industrie (+) Limonen sein (Abbildung 1).
Das Projekt gliederte sich in drei Teile. Im ersten Teil sollten Enzyme (Limonen-3-Hydroxylasen) identifiziert werden, die (+) Limonen in die Vorstufe von (-) Menthol, (+) trans-Isopiperitenol, umwandeln können. Um dem Problem der Produkttoxizität entgegenzuwirken, sollte im zweiten Teil die Toleranz des gewählten Produktionsorganismus P. putida KT2440 gegenüber Monoterpenen und deren Monoterpenoid-Derivaten gesteigert werden. Im dritten Teil sollten die identifizierten Hydroxylase-Enzyme im verbesserten P. putida KT2440-Stamm exprimiert werden, um einen Ganzzell-Biokatalysator für den ersten Schritt der zweistufigen ( ) Menthol-Produktion ausgehend von (+) Limonen zu schaffen.
Zur Erreichung dieser Ziele wurden verschiedene genetische/molekularbiologische und analytische Methoden angewendet. Auf diese Weise konnten zwei Cytochrom P450 Monooxygenase-Enzym aus den Pilzen Aureobasidium pullulans und Hormonema carpetanum identifiziert und funktionell in Pichia pastoris exprimiert werden, die die gewünschte Hydroxlierungsreaktion an (+) Limonen mit hoher Stereo- und Regioselektivität katalysieren können. Eine weitere Charakterisierung des Enzyms aus A. pullulans zeigte, dass das Protein neben (+) Limonen auch (-)-Limonen, - und -Pinen sowie 3 Caren hydroxylieren kann.
Des Weiteren konnten im Rahmen dieser Arbeit Mechanismen der mikrobiellen Monoterpenoid-Resistenz von P. putida identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass die verschiedenen getesteten Monoterpene und Monoterpenoide sehr unterschiedlichen Toxizitätsniveaus aufweisen und dass hauptsächlich die Ttg-Efflux-Pumpen von P. putida GS1 für die Toleranz gegenüber vielen der getesteten Verbindungen verantwortlich sind. Auf Grundlage dieser Ergebnisse konnte dann ein P. putida KT2440-Stamm mit erhöhter Resistenz gegenüber verschiedenen Monoterpenoiden, einschließlich Isopiperitenol, generiert werden, der als Wirtsorganismus für die weitere Entwicklung von Monoterpenoid-produzierenden Zellfabriken genutzt werden kann.
Während im Rahmen dieser Arbeit die heterologe Expression des pilzlichen Limonen-3-Hydroxylase-Gens in einer funktionalen Form in prokaryotischen Zellen trotz verschiedener Ansatzpunkte nicht mehr realisiert werden konnte, bilden die identifizierten Enzyme, der monoterpenoid-tolerante P. putida-Stamm und ein für die heterologe Gen-Expression in P. putida entwickeltes Plasmid einen Ausgangspunkt für die weitere Entwicklung einer mikrobiellen Zellfabrik für die biotechnologische Monoterpenoid-Produktion
