Vuonna 2011 Suomesta löydettiin uusi perinnöllinen sairaus, jonka todettiin olevan lähtöisin Pohjois-Karjalan alueelta ja siten osa suomalaista tautiperimää. Taudin nimi on Jokela tyypin spinaalinen lihasatrofia (Spinal Muscular Atrophy of Jokela Type = SMAJ) ja sitä sairastaa yhteensä arviolta 200–400 potilasta. SMAJ on autosomaalisesti vallitseva, alempien liikehermosolujen rappeumasairaus, jonka aiheuttaa pistemutaatio c.197G>T geenissä CHCHD10 ja yhden aminohapon vaihtuminen p.G66V vastaavassa proteiinissa. CHCHD10 on saman nimisestä geenistä tuotettu proteiini, jota esiintyy mitokondrioiden ulko- ja sisäkalvon välissä. Sen tarkkaa toimintaa ei tunneta, eikä miten mutaatio siihen vaikuttaa. Taudin aiheuttavan mekanismin selvittäminen on kuitenkin olennaisen tärkeää, jotta mahdollisia hoitoja ja diagnostisia testejä on mahdollista kehittää. Tutkielman tavoite on korjata tämä mutaatio heterotsygootin SMAJ-potilaan myoblasteissa (lihassolun esiaste) käyttämällä CRISPR-Cas9 geenieditointi teknologiaa. Korjaamalla mutaatio, voidaan luoda solulinja, joka on muuten täysin identtinen potilaan solujen kanssa, mutta mutaatio geenissä CHCHD10 on korjattu vastaamaan normaalia. Vertailemalla tätä solulinjaa potilaan soluihin, voidaan selvittää ainoastaan mutaatiosta johtuvat erot soluissa.
Tutkielmassa pyritään selvittämään taudin aiheuttavan mutaation vaikutuksia ihmisen lihassoluissa. Myoblasti-solujen CRISPR-Cas9 geenieditointi ei ole yleistä, sillä usein vastaavan kaltaisia tutkimuksia tehdään indusoiduilla kantasoluilla, joista kohdekudoksen soluja on helppo erilaistaa. Nyt käytettävissä oli kuitenkin potilaan tutkimuskäyttöön luovuttamia lihaksen kantasoluja ja oli mielenkiintoista tutkia mitokondriaalisen CHCHD10 proteiinin aiheuttamaa tautia mitokondriorikkaissa lihassoluissa. CRISPR-Cas9 ribonukleproteiinikompleksia (RNP) ja sitä vastaavaa korjaustemplaattia käytettiin mutaation korjaamisessa. RNP-kompleksi transfektoitiin soluihin elektroporaation avulla, jota ennen elektroporaatio-olosuhteet optimoitiin lihassoluille edullisiksi. Elektroporoitujen solulinjojen geenieditoinnin onnistuminen arvioitiin sekä restriktioentsyymianalyysin, että Synthego ICE CRISPR internettyökalun avulla. Klonaaliset solulinjat luotiin fluoresenssiavusteisella solun lajittelu teknologialla (FACS) ja manuaalisesti poimimalla kolonioita solu maljoilta. Kloonien genotyypit selvitettiin Sanger sekvensoimalla ja arvioitiin off-target geenieditoinnin varalta.
Yksi korjattu solulinja saatiin valmistettua ja geenieditointiprosessin optimisaatio myoblasti-soluille onnistui. Tuotetun isogeenisen solulinjan avulla voidaan tulevaisuudessa tutkia CHCHD10:n proteiini- ja mRNA-tasojen eroja verrattuna potilassolulinjaan, ja näin saada arvokasta informaatiota sairauden vaikutuksista lihassoluissa. Tulevaisuuden tehtäviin lukeutuu myös mutaation vaikutuksien hermolihasliitokseen tutkiminen indusoiduista kantasoluista erikoistettujen hermosolujen avulla. Yhteissolukulttuurit mahdollistavat editoitujen myoblastien, sekä hermosolujen kasvattamisen ja hermolihasliitoksen tutkimisen in vitro. Hermolihasliitos on tärkeä yhdistäjä alempien liikehermosolujen ja luustolihasten välissä ja mutaation vaikutuksen tutkiminen voisi valaista SMAJ-tautimekanismia entisestään.Spinal muscular atrophy of Jokela type (SMAJ) is an autosomal dominant motor-neuron disease caused by a missense mutation c.197G>T, p.G66V in the gene CHCHD10. Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 10 (CHCHD10) is a nuclear-encoded mitochondrial protein located in the intermembrane space (IMS) of mitochondria with an unknown exact function and disease-causing mechanism. In this project, the overarching aim was to correct a heterozygous SMAJ-causing mutation in patient myoblast cells with CRISPR-Cas9 genome editing. The goal was to create a genetically identical, isogenic, cell line to study only the effects of the mutation on cellular phenotype in vitro. Human myoblast cells isolated from patient biopsies provide the most pertinent experimental model to study neuromuscular atrophy-associated mutations in their natural genomic environment.
More specific aims included genome editing optimization with myoblast cells, since it is not as widely conducted as with some other cell types, such as iPSCs. CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complex and associated donor template were used to induce homology-directed repair (HDR) in the genome of patient-derived myoblast cells and correct the mutation. After optimization of electroporation conditions for myoblast cells, guide RNAs were designed and transfected into patient myoblasts. Clonal cell lines were made by utilizing techniques such as fluorescence adjusted cell sorting (FACS) and manual colony picking. The success and precision of genome editing were analyzed by Sanger sequencing, comparing the performance of the different guide RNAs with restriction enzyme analysis and Synthego ICE CRISPR web tool, and screening regions of potential off-target genome editing.
A genome-edited myoblast cell line with the CHCHD10 c.197G>T mutation corrected, was successfully generated to provide an isogenic control for the patient myoblast cell line. Optimization of myoblast electroporation was successful and conditions used proved to be effective. Clonal cell line creation proved to be challenging with myoblast cells and work is still needed to improve the viability of single-cell clones after FACS. Nevertheless, the advances taken here regarding myoblast genome editing with CRISPR-Cas9 offer a fertile avenue for future research of myoblasts genome manipulation, myogenic disorders, and the role of CHCHD10 in skeletal muscle and SMAJ. Comparing the CHCHD10 protein level and mRNA expression between patient cells, corrected myoblasts, and differentiated myotubes is an area of future research. Future work also includes measuring the mitochondrial integrated stress response in both cell lines and co-culturing myotubes and iPSC derived motor neurons to study the effects of p.G66V on neuromuscular junction (NMJ) formation
