Die Verkürzung oder Expansion von sich wiederholenden Trinukleotidesequenzen, sogenannten „Trinukleotid‐repeats“ (TNR), ist die Ursache für neurodegenerative Krankheiten wie Friedreichs Ataxie (GAA), die Huntington‐Krankheit (CAG) oder das Fragile‐X‐Syndrom (CGG). Lange TNR Sequenzen können alternative DNS‐ Sekundärstrukturen in vitro bilden und hemmen das Fortschreiten von DNS Replikationsgabeln in Hefezellen und Bakterien. In menschlichen Zellen sind die molekularen Mechanismen, die die DNS Replikation beeinträchtigen und zur Expansion der TNR führen, allerdings weitgehend unbekannt. Wir haben ein experimentelles System etabliert, um die in vivo Replikationsstrukturen („replication intermediates“, RI) zu analysieren, die bei der DNS Replikation von GAA‐Trinukleotidsequenzen entstehen. Dabei transfizieren wir humane Zellen mit Plasmiden, die GAA‐Sequenzen in unterschiedlichen Längen und Orientierungen enthalten. Nach Replikation dieser Plasmide in den transfizierten Zellen isolieren wir die RI und analysieren sie mittels bidimensionalen (2D) Agarosegeln und dem Elektronenmikroskop (EM).
Unsere 2D‐Gel‐Analysen von RI aus humanen 293T und U2OS Zellen zeigt, dass Replikationsgabeln durch GAA‐Sequenzen nur transient angehalten werden, und dass dieser Effekt von der Länge und Orientierung der TNR abhängt. Zu unserer Überraschung haben wir ausserdem noch weitere Signale in unseren 2D‐Gelen erhalten, deren Auftreten mit der Länge von TNR, bei der Symptome von Friedreichs Ataxie (FRDA) auftreten, korreliert. Mit Hilfe des EM haben wir sowohl die gesamte RI Population, als auch die Moleküle, die wir durch Elution der genannten Signale aus unseren 2D‐Gelen isoliert haben, umfassend analysiert. Dabei haben wir erstmals hoch aufgelöste Bilder der Strukturen gewonnen, mit denen Schwesterchromatiden unmittelbar hinter der Replikationsgabel miteinander verbunden sind. Bei ungestörter Replikation sind diese Verbindungen willkürlich über die gesamte Länge der replizierten Moleküle verteilt. Im Gegensatz dazu führen expandierte GAA‐Sequenzen zu einer Stabilisierung dieser Verbindungen in der repetitiven Sequenz. Darüber hinaus führen GAA‐Sequenzen zur Reversion der Replikationsgabel in vivo und beeinflussen gleichzeitig die Stabilität der zweiten Replikationsgabel des Replikons. Die Ergebnisse unsere Experimente legen nahe, dass postreplikative Strukturen für die GAA
Triplettexpansion und damit für das Auftreten von Friedreichs Ataxie verantwortlich sind. Ähnliche Vorgänge könnten ursächlich für die Expansion andere TNR‐Sequenzen sein, die mit einer wachsenden Zahl neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht werden.
Die experimentelle Identifikation an der Expansion von GAA‐Sequenzen beteiligter zellulärer Faktoren und die Entwicklung effektiver Diagnosetechniken sind bisher durch methodische Schwierigkeiten bei der Detektion expandierter TNR eingeschränkt. Für eine effektive Diagnose und ein tieferes Verständnis der molekularen Grundlagen der FRDA sind die schnelle und zuverlässige Detektion expandierter TNR aber Voraussetzung. Ausgehend von isolierter DNS mit GAA‐Sequenzen und den damit verbundenen alternativen Strukturen haben wir in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Dr. Toshio Mori einen Antikörper etabliert, der spezifisch DNS Epitope in expandierten GAA‐Sequenzen erkennt. Unsere in vitro Experimente haben die Spezifität dieses Antikörpers bestätigt, aber auch gezeigt, dass eine Detektion von GAA‐assoziierten Strukturen in vivo aufgrund des hohen Überschusses normaler DNS mit diesem Antikörper nicht möglich ist. Daher haben wir uns auf die Verfeinerung unserer in vitro Techniken konzentriert, um das analytische Potential dieses Antikörpers optimal auszunutzen und zusätzliche Informationen über den Einfluss von GAA‐Sequenzen sowohl auf die DNS Replikation als auch auf die Transkription zu gewinnen