Structural analysis of DNA replication across unstable repetitive sequences

Abstract

Die  Verkürzung  oder  Expansion  von  sich  wiederholenden  Trinukleotidesequenzen,  sogenannten  „Trinukleotid‐repeats“  (TNR),  ist  die  Ursache  für  neurodegenerative  Krankheiten  wie  Friedreichs  Ataxie  (GAA),  die  Huntington‐Krankheit  (CAG)  oder  das  Fragile‐X‐Syndrom  (CGG).  Lange  TNR  Sequenzen  können  alternative  DNS‐ Sekundärstrukturen  in  vitro  bilden  und  hemmen  das  Fortschreiten  von  DNS  Replikationsgabeln  in  Hefezellen  und  Bakterien.  In  menschlichen  Zellen  sind  die molekularen Mechanismen, die die DNS Replikation beeinträchtigen und zur Expansion  der  TNR  führen,  allerdings  weitgehend  unbekannt.  Wir  haben  ein  experimentelles  System etabliert, um die in vivo Replikationsstrukturen („replication intermediates“, RI)  zu analysieren, die bei der DNS Replikation von GAA‐Trinukleotidsequenzen entstehen.  Dabei  transfizieren  wir  humane  Zellen  mit  Plasmiden,  die  GAA‐Sequenzen  in  unterschiedlichen  Längen  und  Orientierungen  enthalten.  Nach  Replikation  dieser  Plasmide  in  den  transfizierten  Zellen  isolieren  wir  die  RI  und  analysieren  sie  mittels  bidimensionalen (2D) Agarosegeln und dem Elektronenmikroskop (EM).  Unsere  2D‐Gel‐Analysen  von  RI  aus  humanen  293T  und  U2OS  Zellen  zeigt,  dass  Replikationsgabeln  durch  GAA‐Sequenzen  nur  transient  angehalten  werden,  und  dass  dieser  Effekt  von  der  Länge  und  Orientierung  der  TNR  abhängt.  Zu  unserer  Überraschung haben wir ausserdem noch weitere Signale in unseren 2D‐Gelen erhalten,  deren  Auftreten  mit  der  Länge  von  TNR,  bei  der  Symptome  von  Friedreichs  Ataxie  (FRDA)  auftreten,  korreliert.  Mit  Hilfe  des  EM  haben  wir  sowohl  die  gesamte  RI  Population,  als  auch  die  Moleküle,  die  wir  durch  Elution  der  genannten  Signale  aus  unseren 2D‐Gelen isoliert haben, umfassend analysiert. Dabei haben wir erstmals hoch  aufgelöste  Bilder  der  Strukturen  gewonnen,  mit  denen  Schwesterchromatiden  unmittelbar  hinter  der  Replikationsgabel  miteinander  verbunden  sind.  Bei  ungestörter  Replikation  sind  diese  Verbindungen  willkürlich  über  die  gesamte  Länge  der  replizierten Moleküle verteilt. Im Gegensatz dazu führen expandierte GAA‐Sequenzen zu  einer  Stabilisierung  dieser  Verbindungen  in  der  repetitiven  Sequenz.  Darüber  hinaus  führen  GAA‐Sequenzen  zur  Reversion  der  Replikationsgabel  in  vivo  und  beeinflussen  gleichzeitig  die  Stabilität  der  zweiten  Replikationsgabel  des  Replikons.  Die  Ergebnisse  unsere  Experimente  legen  nahe,  dass  postreplikative  Strukturen  für  die  GAA Triplettexpansion  und  damit  für  das  Auftreten  von  Friedreichs  Ataxie  verantwortlich  sind.  Ähnliche  Vorgänge  könnten  ursächlich  für  die  Expansion  andere  TNR‐Sequenzen  sein,  die  mit  einer  wachsenden  Zahl  neurodegenerativer  Erkrankungen  in  Verbindung  gebracht werden.  Die  experimentelle  Identifikation  an  der  Expansion  von  GAA‐Sequenzen  beteiligter  zellulärer Faktoren und die Entwicklung effektiver Diagnosetechniken sind bisher durch  methodische  Schwierigkeiten  bei  der  Detektion  expandierter  TNR  eingeschränkt.  Für  eine  effektive  Diagnose  und  ein  tieferes  Verständnis  der  molekularen  Grundlagen  der  FRDA  sind  die  schnelle  und  zuverlässige  Detektion  expandierter  TNR  aber  Voraussetzung.  Ausgehend  von  isolierter  DNS  mit  GAA‐Sequenzen  und  den  damit  verbundenen alternativen Strukturen haben wir in Zusammenarbeit mit der Gruppe von  Dr. Toshio Mori einen Antikörper etabliert, der spezifisch DNS Epitope in expandierten  GAA‐Sequenzen  erkennt.  Unsere  in  vitro  Experimente  haben  die  Spezifität  dieses  Antikörpers  bestätigt,  aber  auch  gezeigt,  dass  eine  Detektion  von  GAA‐assoziierten  Strukturen  in  vivo  aufgrund  des  hohen  Überschusses  normaler  DNS  mit  diesem  Antikörper nicht möglich ist. Daher haben wir uns auf die Verfeinerung unserer in vitro  Techniken  konzentriert,  um  das  analytische  Potential  dieses  Antikörpers  optimal  auszunutzen  und  zusätzliche  Informationen  über  den  Einfluss  von  GAA‐Sequenzen  sowohl auf die DNS Replikation als auch auf die Transkription zu gewinnen