Cloning of NADP-ME family gene and studying the function of its chloroplast gene

Abstract

NADP-苹果酸酶（NADP-ME） 是苹果酸代谢通路中的关键酶， 它不仅参与植物的光合作用， 还参与植物的环境逆境防御及相关代谢活动。 课题组前期的研究表明， C3-C4中间型植物松叶猪毛菜通过增强 C4途径来抵御干旱胁迫， 并且在所研究的光合酶中， 仅有 NADP-ME 活性在不同程度的干旱胁迫下都显著升高，暗示该基因在松叶猪毛菜响应逆境胁迫中具有重要作用。 并且， 植物光合基因NADP-ME 进化关系复杂， 为我们认识 C4光合基因的进化提供了很好的素材。本研究拟克隆松叶猪毛菜 NADP-ME 家族基因， 分析 NADP-ME 组织表达特性及响应逆境胁迫的模式， 并验证松叶猪毛菜叶绿体型 NADP-ME 在非生物胁迫下（光照、 干旱和盐） 的功能； 同时探究 NADP-ME 家族基因在被子植物中的动态演化规律。 主要结果如下：1. 基于松叶猪毛菜的根、 茎和叶混库建立的转录组数据， 本文克隆获得了 3条 NADP-MEs， 命名为 Salchl， Salcyt1 和 Salcyt2。 ①它们的 CDS（编码氨基酸的序列） 长度分别为 1941 bp， 1755 bp， 1758 bp， 编码 646， 584， 585 个氨基酸，这 3 个基因均含有 NADP-ME 的 5 个保守结构域。 ②通过亚细胞定位研究表明，Salchl 编码的蛋白定位于叶绿体， Salcyt1 和 Salcyt2 编码的蛋白均定位于细胞质。③在转录水平上， 这 3 个基因在松叶猪毛菜根、 茎和叶中都有表达， 但没有明显的组织特异性表达模式； 在强光、 干旱和盐胁迫下松叶猪毛菜幼苗根和叶中这 3个 NADP-ME 具有不同基因转录表达方式， 其中 Salchl 的转录表达被这 3 种处理显著诱导， 且在根和叶中有一致性。2. 将 Salchl 稳定转化至拟南芥中进行功能验证。 结果表明： ①正常条件下，过表达 Salchl 能提高转基因拟南芥植株的光合能力。 与 WT 相比， 转基因植株的光系统相关基因（Psb D、 Psb Q、 Psa F、 Psa H） 和捕光色素相关基因（CHL M、Por B、 LHC A2、 LHC H4、 LHC B3） 的表达量、 ETR（光合电子传递速率） 、 Y（II） （实际光能转化效率） 以及叶绿素含量都有明显的增加； ②对 WT 和过表达 Salchl 转拟南芥植株进行强光、 干旱和盐胁迫下的对比研究， 与 WT 相比， 种子萌发阶段， 过表达 Salchl 不能提高植株抗盐、 强光和干旱能力； 幼苗阶段过表达 Salchl 能不同程度的提高拟南芥植株的根长， 鲜重和侧根数目； 在成苗阶段，盐， 干旱和强光胁迫下， 过表达 Salchl 拟南芥的 H2O2含量减少， 脯氨酸含量增加， 表明过表达 Salchl 能提高植株抗逆能力。 盐和强光胁迫下， 转基因植株 ROS酶促系统的 SOD， POD 和 CAT 含量增加； 干旱胁迫下， 转基因植物 ROS 非酶促系统的 ASA/DHA， GSH/GSSG 比值增加。 并且， 在 3 种非生物胁迫下， 转基因植株的光能转化速率及电子传递能力都增加3.基于涵盖被子植物关键节点的 64 个物种的 282 条 NADP-ME 序列， 并以藻类、 苔藓、 蕨类和裸子植物的 10 个物种的 28 条 NADP-ME 序列为外类群， 从系统发育和序列特征入手， 利用生物信息学手段探究 NADP-ME 家族在被子植物中的演化历史。 结果表明： ①单/双子叶植物的 NADP-MEs 在基因复制/丢失事件、基序组成和分布上均存在差异。 ②与 NADP-ME 的 5 个保守域相比， 胞质型NADP-ME 序列在每个保守区域都发生许多变化。 但质体型 NADP-ME 只在保守区 II 的保守序列中存在较多的变化。 ③4 条藻类植物序列位于外类群基部且与其他外类群序列区分开来。 将这些被子植物的 NADP 分为 5 个类型， 包括 2 个双子叶胞质型（I 和 III） ， 其中双子叶胞质型首先分化出来； 双子叶质体型（II） ，嵌套在双子叶胞质型中； 1 个单子叶胞质型（IV） 和 1 个单子叶质体型（V） 。④根据系统发育树、 蛋白质长度和内含子数目的不同， 将 V 组分为两个支持良好的亚组（V-1 和 V-2） 。 ⑤在 V-1 中， 光合型 NADP-ME 嵌套在质体型非光合型 NADP-ME 中， 两者在内含子数目和蛋白质长度上有相似性。以上研究结果阐明了松叶猪毛菜 NADP-ME 家族基因的特性， 并确定了非生物胁迫下（强光、 干旱和盐） Salchl 的抗逆功能， 同时， 理清了 NADP-ME 家族（特别是对于质体亚型） 在被子植物中的系统发育关系