Caractérisations structurale et fonctionnelle des protéines associées aux nucléoïdes de Deinococcus radiodurans et Deinococcus deserti

Abstract

The bacterium Deinococcus radiodurans is one of the most radiation resistant organisms on earth. This resistance results from multiple mechanisms, including an unusual nucleoid organization. The aim of my thesis was to better understand the organization and dynamics of the nucleoids of D. radiodurans and Deinococcus deserti, a bacterium isolated from the Sahara Desert that also exhibits a strong resistance to UV and ionizing radiation and to prolonged desiccation. Specifically, my studies focused on the nucleoid-associated proteins (or NAPs) of these bacteria - the HU proteins and DNA gyrase which are the most abundant - as well as a Deinococcus-specific NAP, DdrC. The objective was to elucidate the three-dimensional structure of these proteins, to characterize their interactions with DNA, and finally to study their effects on the conformation and compaction of plasmid DNA.Through biochemical studies and atomic force microscopy and electron microscopy analyses, we have highlighted significant differences in the mechanisms of compaction and DNA binding used by the different HU protein homologues from D. radiodurans (DrHU) and D. deserti (DdHU1, DdHU2 and DdHU3). In particular, we have demonstrated a dual role for DrHU in the organization and compaction of plasmid DNA, which can be either condensed or rigidified depending on the concentration of DNA-bound DrHU - a dual function that is not conserved in DdHU1, its closest homolog. We also succeeded in producing two forms of the DNA gyrase, an active form that can be used for functional studies, and a second, more stable, but less active form that is more suitable for structural studies. Finally, our structural studies of DdrC coupled with biochemical and molecular dynamics analyses revealed the three-dimensional structure of DdrC, its oligomerization state, and its mode of binding to DNA. These results suggest that DdrC may be a Deinococcus-specific NAP, playing a key role in nucleoid compaction after irradiation and perhaps more broadly in the DNA damage response of these bacteria. Together, these studies have provided a better understanding of the molecular mechanisms used by these radio-resistant bacteria to organize and structure their nucleoid and respond efficiently to genotoxic stresses such as irradiation.La bactérie Deinococcus radiodurans est l’un des organismes les plus radio-résistants sur terre. Cette résistance résulte d’un ensemble de mécanismes, dont une structuration particulière de son nucléoïde. Mes travaux de thèse avaient pour but de mieux appréhender l’organisation et la dynamique des nucléoïdes de D. radiodurans et de Deinococcus deserti, une bactérie isolée dans le désert du Sahara et présentant également une forte résistance aux rayonnements UV et ionisants et à une dessiccation prolongée. Plus précisément, mes études ont porté sur les protéines associées au nucléoïde (ou NAPs) de ces bactéries - les protéines HU et l'ADN gyrase qui sont les plus abondantes - ainsi qu’une NAP spécifique des Deinococcus, DdrC. L'objectif était d'élucider la structure tridimensionnelle de ces protéines, de caractériser leurs interactions avec l’ADN, et enfin d'étudier leurs effets sur la conformation et la compaction d’ADN plasmidique.Par des études biochimiques et des analyses par microscopie à force atomique et par microscopie électronique, nous avons mis en lumière des différences notables dans les mécanismes de compaction et de liaison à l'ADN entre les différents homologues de la protéine HU de D. radiodurans (DrHU) et de D. deserti (DdHU1, DdHU2 et DdHU3). En particulier, nous avons démontré un double rôle de DrHU dans l’organisation et la compaction de l’ADN plasmidique, qui peut être condensé ou rigidifié en fonction de la concentration de DrHU liée à l’ADN - une double fonction qui n’est pas conservée chez DdHU1, son plus proche homologue. Nous avons également réussi à produire deux formes de l’ADN gyrase, une forme active pouvant être utilisée pour des études fonctionnelles, et une deuxième plus stable, mais moins active, qui est plus adaptée pour des études structurales. Enfin, nos études structurales de DdrC couplées à des analyses biochimiques et de dynamique moléculaire ont révélé la structure tridimensionnelle de DdrC, son état d’oligomérisation et son mode de fixation à l’ADN. Ces résultats suggèrent que DdrC pourrait être une NAP spécifique des Deinococcus, jouant un rôle clé dans la compaction du nucléoïde après irradiation et peut-être plus largement dans la réponse de ces bactéries aux dommages de l’ADN. Ensemble, ces études ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires mis en œuvre par ces bactéries radio-résistantes pour organiser et structurer leur nucléoïde et répondre de façon efficace à des stress génotoxiques tels que l’irradiation